یک فناوری qPCR برای کمیسازی مستقیم متیلاسیون در DNA تیمارنشده
A qPCR technology for direct quantification of methylation in untreated DNA
یک فناوری qPCR برای کمیسازی مستقیم متیلاسیون در DNA تیمارنشده
Abstract
DNA methylation is important for gene expression and alterations in DNA methylation are involved in the development and progression of cancer and other major diseases. Analysis of DNA methylation patterns has until now been dependent on either a chemical or an enzymatic pre-treatment, which are both time consuming procedures and potentially biased due to incomplete treatment. We present a qPCR technology, EpiDirect®, that allows for direct PCR quantification of DNA methylations using untreated DNA. EpiDirect® is based on the ability of Intercalating Nucleic Acids (INA®) to differentiate between methylated and unmethylated cytosines in a special primer design. With this technology, we develop an assay to analyze the methylation status of a region of the MGMT promoter used in treatment selection and prognosis of glioblastoma patients. We compare the assay to two bisulfite-relying, methyl-specific PCR assays in a study involving 42 brain tumor FFPE samples, revealing high sensitivity, specificity, and the clinical utility of the method.
چکیده
متیلاسیون DNA (DNA methylation) برای بیان ژن (gene expression) اهمیت دارد و تغییرات در متیلاسیون DNA (DNA methylation) در توسعه و پیشرفت سرطان (cancer) و سایر بیماریهای عمده (major diseases) نقش دارند. تحلیل الگوهای متیلاسیون DNA (DNA methylation patterns) تاکنون به یک پیشتیمار شیمیایی (chemical pre-treatment) یا آنزیمی (enzymatic pre-treatment) وابسته بوده است که هر دو فرآیندهایی زمانبر (time consuming procedures) هستند و بهطور بالقوه به دلیل تکمیلنشدن کامل فرآیند، دچار سوگیری (bias) میشوند. ما یک فناوری qPCR (qPCR technology)، با نام EpiDirect® (EpiDirect®)، ارائه میکنیم که امکان کمیسازی مستقیم PCR (PCR quantification) از متیلاسیون DNA (DNA methylations) را با استفاده از DNA (DNA) تیمارنشده (untreated DNA) فراهم میسازد. EpiDirect® (EpiDirect®) بر توانایی اسیدهای نوکلئیک بیننشانیشونده (Intercalating Nucleic Acids, INA®) (Intercalating Nucleic Acids) استوار است که قادرند سیتوزینهای متیله (methylated cytosines) را از سیتوزینهای غیرمتیله (unmethylated cytosines) در یک طراحی ویژه پرایمر (special primer design) متمایز کنند. با استفاده از این فناوری، ما یک آزمون (assay) برای تحلیل وضعیت متیلاسیون (methylation status) ناحیهای از پروموتر MGMT (MGMT promoter) توسعه دادیم که در انتخاب درمان (treatment selection) و پیشآگهی (prognosis) بیماران گلیوبلاستوما (glioblastoma patients) مورد استفاده قرار میگیرد. ما این آزمون را با دو آزمون PCR اختصاصی متیلاسیون (methyl-specific PCR assays) وابسته به بیسولفیت (bisulfite-relying) مقایسه کردیم، در مطالعهای شامل ۴۲ نمونه تومور مغزی FFPE (FFPE brain tumor samples)، که در آن حساسیت (sensitivity)، ویژگی (specificity) بالا و کاربرد بالینی (clinical utility) این روش نشان داده شد.
Introduction
DNA methylation is an epigenetic modification of the DNA, where especially the methylation of cytosine, occurring by the addition of a methyl group to the fifth carbon of cytosine creating 5-methylcytosine (5mC), is of interest. Abnormal alterations in DNA methylation patterns have been associated with the development of cancer and other human diseases1,2,3. Methylation patterns of specific genes have been shown to have clinical significance with relevant prognostic, diagnostic, and predictive roles. Current clinically relevant methylation markers within cancer include MGMT, MLH1, GSTP1, SEPT9, and LINE-14,5. O6-methylguanine-DNA methyltransferase-encoding gene (MGMT) is used as a predictive marker for response to temozolomide (TMZ) in patients with gliomas, where hypermethylation of the MGMT promoter is associated with increased efficacy of TMZ6,7. MGMT methylation is also a prognostic marker; patients with hypermethylated MGMT have been found to have a better prognosis irrespective of the choice of treatment6.
مقدمه
متیلاسیون DNA (DNA methylation) یک اصلاح اپیژنتیک (epigenetic modification) در DNA است که در آن بهویژه متیلاسیون سیتوزین (cytosine methylation)، که از طریق افزودن یک گروه متیل (methyl group) به کربن پنجم سیتوزین (cytosine) و ایجاد 5-متیلسیتوزین (5-methylcytosine, 5mC) رخ میدهد، مورد توجه قرار دارد (1,2,3). تغییرات غیرطبیعی در الگوهای متیلاسیون DNA (DNA methylation patterns) با توسعه سرطان (cancer) و سایر بیماریهای انسانی (human diseases) مرتبط دانسته شدهاند (1,2,3). الگوهای متیلاسیون ژنهای خاص (specific genes methylation patterns) نشان دادهاند که دارای اهمیت بالینی (clinical significance) با نقشهای پیشآگهی (prognostic)، تشخیصی (diagnostic) و پیشبینیکننده (predictive) هستند (1,2,3). نشانگرهای متیلاسیون (methylation markers) دارای اهمیت بالینی در سرطان (cancer) شامل MGMT (MGMT)، MLH1 (MLH1)، GSTP1 (GSTP1)، SEPT9 (SEPT9) و LINE-1 (LINE-1) هستند (4,5). ژن کدکننده O6-متیلگوانین-DNA متیلترانسفراز (O6-methylguanine-DNA methyltransferase-encoding gene, MGMT) بهعنوان یک نشانگر پیشبینیکننده (predictive marker) برای پاسخ به تموزولوماید (temozolomide, TMZ) در بیماران مبتلا به گلیوما (gliomas) به کار میرود، بهطوری که هایپرمتیلاسیون پروموتر MGMT (MGMT promoter hypermethylation) با افزایش اثربخشی تموزولوماید (TMZ efficacy) همراه است (6,7). متیلاسیون MGMT (MGMT methylation) همچنین یک نشانگر پیشآگهی (prognostic marker) است؛ بهطوری که بیماران دارای هایپرمتیلاسیون MGMT (MGMT hypermethylation) صرفنظر از انتخاب نوع درمان، پیشآگهی بهتری (better prognosis) نشان دادهاند (6).
The analysis of DNA methylation remains a challenging task. DNA methylation cannot be analyzed directly using standard PCR approaches because the methylation patterns are not maintained during the amplification. The most utilized methods for methylation analyses overcome this issue by making a permanent chemical conversion of purified DNA using a sodium bisulfite treatment prior to PCR. The sodium bisulfite treatment converts unmethylated cytosines to uracils while leaving 5mC unchanged. This creates a sequence difference between unmethylated and methylated DNA, that is easily analyzed using approaches like methyl-specific PCR (MSP)8 or pyrosequencing9. Other approaches include qMSP and methyl-sensitive high-resolution melt allowing for relative quantification of the methylation status in a PCR cycler10,11. High differences in recovery, conversion efficiency, and conversion specificity of bisulfite have been observed in different kits from various manufacturers12,13,14,15, potentially leading to differences in precision between kits. Lastly, bisulfite treatment is harsh on the DNA, causing degradation of the DNA, which especially can pose a challenge when having small biopsies, e.g., formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) biopsies from brain tumor or cell-free DNA from liquid biopsies. Hence attempts have been made to develop bisulfite-free analysis methods.
تحلیل متیلاسیون DNA همچنان یک چالش مهم به شمار میرود. متیلاسیون DNA را نمیتوان بهطور مستقیم با روشهای استاندارد PCR (PCR) تحلیل کرد، زیرا الگوهای متیلاسیون (methylation patterns) در طول تکثیر (amplification) حفظ نمیشوند. رایجترین روشهای مورد استفاده برای تحلیل متیلاسیون (methylation analyses) این مشکل را با ایجاد یک تبدیل شیمیایی دائمی (chemical conversion) از DNA خالصشده (purified DNA) با استفاده از تیمار بیسولفیت سدیم (sodium bisulfite treatment) پیش از PCR (PCR) برطرف میکنند. تیمار بیسولفیت سدیم (sodium bisulfite treatment) سیتوزینهای غیرمتیله (unmethylated cytosines) را به یوراسیلها (uracils) تبدیل میکند، در حالی که 5-متیلسیتوزین (5-methylcytosine, 5mC) بدون تغییر باقی میماند. این فرآیند یک تفاوت توالی (sequence difference) میان DNA غیرمتیله (unmethylated DNA) و DNA متیله (methylated DNA) ایجاد میکند که بهراحتی با روشهایی مانند PCR اختصاصی متیلاسیون (methyl-specific PCR, MSP) (8) یا پيروسکوئنسینگ (pyrosequencing) (9) قابل تحلیل است. روشهای دیگر شامل qMSP (quantitative MSP, qMSP) و ذوب با وضوح بالای حساس به متیلاسیون (methyl-sensitive high-resolution melt) هستند که امکان کمیسازی نسبی (relative quantification) وضعیت متیلاسیون (methylation status) را در دستگاه PCR (PCR cycler) فراهم میکنند (10,11). اختلافات قابل توجهی در میزان بازیابی (recovery)، کارایی تبدیل (conversion efficiency) و اختصاصیت تبدیل (conversion specificity) بیسولفیت (bisulfite) در کیتهای مختلف تولیدکنندگان گوناگون مشاهده شده است (12,13,14,15) که میتواند به تفاوت در دقت (precision) بین کیتها منجر شود. در نهایت، تیمار بیسولفیت (bisulfite treatment) برای DNA خشن است و موجب تخریب DNA (DNA degradation) میشود، که این موضوع بهویژه در نمونههای کوچک بیوپسی (small biopsies) چالشبرانگیز است؛ مانند بیوپسیهای تثبیتشده در فرمالین و پارافین (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) از تومورهای مغزی (brain tumor) یا DNA آزاد سلولی (cell-free DNA) از بیوپسیهای مایع (liquid biopsies). بنابراین تلاشهایی برای توسعه روشهای تحلیل بدون بیسولفیت (bisulfite-free analysis methods) انجام شده است.
One of the most applied bisulfite-free methods involves enzymatic digestion by methylation-sensitive restriction enzymes (MSREs)16,17 followed by a methyl-specific-multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA)18. The use of MSREs is less harsh on the DNA compared to bisulfite treatment. However, the MSREs are sequence-dependent, limiting this test for methylation evaluation only to some regions containing the restriction sites. Newer methods include TET-assisted pyridine borane sequencing (TAPS) which allows base-level sequencing of the DNA19, by enzymatic oxidation and reduction by pyridine borane creating dihydrouracil, which will be read as thymine during sequencing. The other method is Enzymatic Methyl-seq (EM-seq)20 which applies only enzymatic steps to deaminate cytosine while 5mC remains unchanged. However, all these methods are time-consuming and require multiple hands-on steps.
یکی از روشهای بدون بیسولفیت (bisulfite-free methods) که بیشترین کاربرد را دارد شامل هضم آنزیمی (enzymatic digestion) توسط آنزیمهای محدودکننده حساس به متیلاسیون (methylation-sensitive restriction enzymes, MSREs) (16,17) و بهدنبال آن آزمون تقویت پروب وابسته به لیگاسیون چندگانه اختصاصی متیلاسیون (methyl-specific-multiplex ligation-dependent probe amplification, MS-MLPA) (18) است. استفاده از MSREs (MSREs) نسبت به تیمار بیسولفیت (bisulfite treatment) برای DNA ملایمتر است. با این حال، MSREs (MSREs) وابسته به توالی (sequence-dependent) هستند، که این موضوع کاربرد این آزمون را برای ارزیابی متیلاسیون (methylation evaluation) تنها به برخی نواحی دارای جایگاههای برش (restriction sites) محدود میکند. روشهای جدیدتر شامل توالییابی TAPS (TET-assisted pyridine borane sequencing, TAPS) (19) است که امکان توالییابی در سطح باز (base-level sequencing) DNA (DNA) را فراهم میکند. این روش از اکسیداسیون آنزیمی (enzymatic oxidation) و کاهش با پیریدین بوران (pyridine borane reduction) استفاده میکند که در نهایت دیهیدرویوراسیل (dihydrouracil) ایجاد میشود؛ و این باز در هنگام توالییابی بهصورت تیمین (thymine) خوانده میشود. روش دیگر، توالییابی متیلاسیون آنزیمی (Enzymatic Methyl-seq, EM-seq) (20) است که تنها از مراحل آنزیمی (enzymatic steps) برای دآمیناسیون (deamination) سیتوزین (cytosine) استفاده میکند، در حالی که 5-متیلسیتوزین (5-methylcytosine, 5mC) بدون تغییر باقی میماند. با این حال، تمام این روشها زمانبر (time-consuming) هستند و نیازمند مراحل متعدد عملیاتی (multiple hands-on steps) میباشند.
In this paper, we use the physiochemical properties of 5mC to develop a qPCR platform for the analysis of DNA methylation without any prior treatment of the DNA. We do so by employing the DNA analog platform called Intercalating Nucleic Acid (INA®) affecting the π-stacking of DNA21. In short, double-stranded DNA is stabilized by Watson-Crick base-pairing and by base-stacking, where the latter has been shown to be the main stabilizer of the DNA double helix22. The base-stacking is the effect of the interactions between the electrons of π-electrons, and thereby also named π-stacking. 5mC has been shown to influence the thermal stability of DNA duplexes even though it does not participate in the Watson-Crick base-paring23,24. INA® comprises a minimum of one nucleobase analog, called an intercalating pseudo-nucleotide (IPN), composed of a flat, conjugated aromatic or heteroaromatic ring system, linked to the phosphodiester backbone at fixed positions of a synthetically manufactured oligonucleotide. The IPN will coaxially stack with the neighboring nucleobases and thereby increase the π-stacking energy of the DNA helix, which increases the melting temperature (Tm)21. The properties of the INA® have among other utilizations been used for sensitive detection of single-point mutations in DNA25.
در این مقاله، ما از ویژگیهای فیزیکوشیمیایی (physiochemical properties) 5-متیلسیتوزین (5-methylcytosine, 5mC) برای توسعه یک پلتفرم qPCR (qPCR platform) جهت تحلیل متیلاسیون DNA (DNA methylation) بدون هیچگونه پیشتیمار (prior treatment) بر روی DNA استفاده میکنیم. این کار را با بهرهگیری از پلتفرم آنالوگ DNA موسوم به اسید نوکلئیک بیننشانیشونده (Intercalating Nucleic Acid, INA®) (21) انجام میدهیم که بر روی π-استکینگ (π-stacking) DNA اثر میگذارد. بهطور خلاصه، DNA دورشتهای (double-stranded DNA) توسط جفتشدن بازهای واتسون–کریک (Watson–Crick base-pairing) و همچنین استکینگ بازها (base-stacking) پایدار میشود؛ که نشان داده شده است مورد دوم عامل اصلی پایداری (main stabilizer) مارپیچ دوگانه DNA (DNA double helix) است (22). استکینگ بازها (base-stacking) نتیجه برهمکنش میان الکترونهای π (π-electrons) است و از این رو π-استکینگ (π-stacking) نیز نامیده میشود. نشان داده شده است که 5-متیلسیتوزین (5mC) بر پایداری حرارتی (thermal stability) دایپلکسهای DNA (DNA duplexes) تأثیر میگذارد، اگرچه خود در جفتشدن واتسون–کریک (Watson–Crick base-pairing) مشارکت ندارد (23,24). INA® شامل حداقل یک آنالوگ نوکلئوباز (nucleobase analog) است که «پسودونوکلئوتید بیننشانیشونده» (intercalating pseudo-nucleotide, IPN) نام دارد. این واحد از یک سیستم حلقهای آروماتیک یا هتروآروماتیک مسطح و مزدوج (flat, conjugated aromatic or heteroaromatic ring system) تشکیل شده است که در موقعیتهای ثابت یک الیگونوکلئوتید سنتزی (synthetically manufactured oligonucleotide) به ستون فقرات فسفودیاستری (phosphodiester backbone) متصل میشود. IPN بهصورت هممحور (coaxially) با بازهای مجاور روی همگذاری (stack) میکند و در نتیجه انرژی π-استکینگ (π-stacking energy) مارپیچ DNA (DNA helix) را افزایش میدهد که این امر موجب افزایش دمای ذوب (melting temperature, Tm) میشود (21). ویژگیهای INA® در میان کاربردهای مختلف خود، برای تشخیص حساس جهشهای تکنقطهای (single-point mutations) در DNA (DNA) نیز مورد استفاده قرار گرفته است (25).
ادامه دارد…
منبع:
A qPCR technology for direct quantification of methylation in untreated DNA
ورود/ ثبت نام با جیمیل
