آزمایش‌های میکروبی آب، شیر مایع، آرد، ماهی‌های آب شور، کمپوت و کنسرو

آزمایش‌های میکروبی برخی از مواد غذایی پرمصرف

آزمایش‌های میکروبی آب

آب، یکی از ساده ترین وسیله‌های انتشار بیماری هاست ؛ زیرا در جوامع شهری و روستایی بیشتر مردم از یک یا چند منبع آب استفاده می‌کنند که در صورت آلودگی ممکن است موجب بیماری گروه‌های وسیعی از مردم بشود.

در صنایع غذایی نیز آب دارای اهمیت بسیار زیادی است. از آب برای شست و شوی مواد اولیه، جابه‌جایی پاره‌ای از مواد اولیه، شست و شوی محیط کار، سرد کردن قوطی‌ها در کنسروسازی و موارد زیاد دیگری، استفاده می‌شود. در پاره‌ای از موارد، از آب به عنوان بخشی از فرمول فرآورده‌ها استفاده می‌شود. بنابراین آلودگی آن ممکن است موجب مسمومیت غذایی مصرف‌کننده فرآورده‌ها و فساد شود.

آزمایش میکروبی کامل آب کمتر مورد نیاز است و در بیشتر موارد آزمایش‌های زیر اکتفا می‌شود.

١– شمارش تعداد کل میکروب‌های زنده (Total viable Count): که برای ارزیابی وضع بهداشتی آب انجام می‌گیرد، و اگر تعداد آنها از حد معینی تجاوز کند آب غیر قابل شرب و مصرف در صنایع غذایی خواهد بود.

۲- شمارش کلیفرم‌ها (Coliforms) و به ویژه شمارش اشریشیاکلی(E. coli): که برای تعیین آلودگی جدید با فاضلاب یا محتویات دستگاه گوارش انسان و حیوان انجام می‌گیرد. بدیهی است آلوده نبودن آب به کلیفرم دلیل سلامت آن نیست، زیرا کلیفرم‌ها پس از مدتی در آب از بین می‌روند یا تعدادشان کاهش می یابد. اما متابولیت‌های آنها در محیط باقی است

۳- آزمایش و شمارش کلستریدیوم ولشای (Clostridium Welchii, CI, Perfringens): وجود این باکتری در آب دلیل آلودگی قبلی آن است، زیرا باکتری اسپر ساز است و اسپر آن تا مدتها در آب زنده می‌ماند.

۴- آزمایش و شمارش استرپتوکوک فکال (Faecal Streptococci): این باکتری، نسبت به کلیفرم‌ها در برابر کلر و ترکیبات آن مقاوم تر است، و در آب کلرینه شده، حضور آن دلیل به کافی نبودن فرآیند کلرزنی (Chlorination) است.

نمونه‌برداری از آب برای آزمایش‌های میکروبی: باید از سوی افراد ورزیده و آشنا به اصول میکروبیولوژی انجام گیرد، تا از آلودگی ثانوی نمونه و تکثیر باکتری‌های موجود در آب قبل از انجام آزمایش جلوگیری شود. برای نمونه‌برداری آب از شیشه‌های ۱۰۰ تا ۲۰۰ میلی لیتری دردار استفاده می‌شود. شیشه‌ها باید پیش از نمونه‌برداری، سترون شده، در ورقه‌های آلومینیومی یا کاغذی پیچیده و بسته بندی شده باشد.

اگر نمونه‌برداری از آب کلر زده شده انجام می‌گیرد لازم است باقیماندهی کلر آب هنگام نمونه‌برداری خنثی شود، برای این منظور، پیش از استریل کردن شیشه نمونه‌برداری، لازم است برای خنثی کردن باقیماندهی کلر، حدود ۱۸ میلی گرم تیوسولفات سدیم در داخل شیشه اضافه شود تا هنگام وارد شدن آب به داخل شیشه، باقیمانده کلر آن خنثی شود و اثر میکروب کشی خود را از دست بدهد.

چنانچه نمونه‌برداری از شیر آب انجام می‌گیرد، لازم است سطح خارجی شیر آب به وسیله‌ی الکل سترون شود یا با آتش زدن پنبه آغشته به الکل و گرفتن آن زیر شیر آب، این کار انجام گیرد و پس از آن شیر آب برای مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه باز گذاشته شود تا نمونه‌ی واقعی تری به دست آید. پس از طی این مدت، در شیشه‌ی ویژه‌ی نمونه‌برداری با دست ضدعفونی شده، باز می‌شود و از آب شیر پر می‌گردد. آن گاه ، در شیشه تهیه شده، در داخل ظرف ویژه‌ی حمل نمونه به آزمایشگاه یا یخدان قرار داده می‌شود و اطراف آن با یخ پوشانده شود تا بلافاصله سرد شده، از تکثیر باکتریها جلوگیری به عمل آید.

آزمایش‌های لازم

١- شمارش تعداد کل میکروب‌های موجود در آب: برای این منظور، ابتدا پنج عدد لوله یا شیشه‌ی حدود ۲۵ میلی لیتری هر یک محتوى نه میلی‌لیتر مایع رقیق‌کننده مانند محلول آب پیتونه با فردار (Buffered Pepton Water) یا محلول رینگر (Ringer) را برداشته، با آن‌ها نمونه آب را تا ^۵-۱۰ رقیق می‌کنیم و همزمان پنج عدد پلیت استریل را نیز علامت گذاری کرده، به ترتیب به هر یک از آنها یک میلی‌لیتر از رقت مربوط را (^۵-۱۰ – ^۱-۱۰) اضافه می‌کنیم و روی هر یک از آنها ده تا پانزده میلی‌لیتر از محیط کشت غذایی آگار (Plate Count Agar) که از پیش آماده شده، سترون و تا حدود ℃۴۵ سرد گردیده است می‌ریزیم و آنها را به حال آرام در جهت عقربه‌های ساعت و بر خلاف آن، به سمت جلو و عقب و چپ و راست می چرخانیم برای هر یک از حرکت‌ها پنج بار کافی است). سرانجام پلیت‌ها را به حال خود قرار می‌دهیم تا آگار سفت شود، لبه‌ی پلیت‌ها را در دمای ℃۲۵ قرار می‌دهیم. برای دقت بیشتر در این آزمایش می توان به همین تعداد و همین روش پلیت‌های دیگری را آماده نمود و در گرمخانه و در دمای ℃۵ و ℃۳۷ قرار داد. پس از ۲۴ ساعت کلنی‌های ظاهر شده روی پلیت‌ها را شمارش می‌کنیم. پلیت هایی که روی آنها بیش از ۳۰۰ کلنی رشد کرده، غیرقابل شمارش گزارش می‌کنیم. از روی رقت‌های تهیه شده در این آزمایش و تعداد کلنی هایی که روی پلیتهای هر رقت رشد کرده، به سادگی می توان به تعداد کل میکروب‌ها در آب پی برد. برای این منظور باید تعداد کلنی ظاهر شده روی پلیتهای هر رقت را در عکس رقت آن ضرب نمود.

۲- شمارش کلیفرم ها: شمارش کلیفرم‌ها با استفاده از روش شمارش لوله هایی از رقت‌های نمونه که در آنها باکتری رشد کرده (Dilution Tube Count) صورت می‌گیرد و در آن از محیط کشت مک کونکی برات (Mc. Conkey broth) استفاده می‌شود. روش آزمایش به این ترتیب است که ابتدا ۱۵ لوله آزمایش حاوی محیط کشت استریل شده و لوله دورهام (Durham) را برداشته، آنها را به سه گروه ۵ تایی تقسیم و علامت گذاری می‌کنیم. سپس به هر یک از ۵ لوله‌ی گروه اول، ۱۰ میلی‌لیتر نمونه آب مورد آزمایش، و به هر یک از ۵ لوله گروه دوم یک میلی لیتر، و به هر یک از ۵ لوله‌ی گروه سوم ۰/۱ میلی‌لیتر نمونه‌ی آب مورد آزمایش را اضافه می‌کنیم و پس از اتمام کار آنها را در گرمخانه ℃۳۰ قرار می‌دهیم و پس از ۲۴ ساعت لوله‌ها را مشاهده می‌نماییم. در صورت مثبت بودن جواب، اسید و گاز تولید می‌شود. اسید رنگ محیط را زرد می‌کند و گاز در لوله دورهام موجود در لوله که به صورت وارونه قرار گرفته جمع می‌شود، که دلیل آلودگی آب با کلیفرم است و از روی تعداد لوله هایی که در آنها رشد مشاهده می‌شود و با استفاده از جداول MPN می توان به تعداد احتمالی کلیفرم در آب پی برد. برای تایید نتیجه‌ی آلودگی، از آزمایش معروف به آیکمن (Eijkman test) استفاده می‌شود.

برای شناسایی کلیفرم‌ها از محیطهای کشت دیگری هم استفاده می‌شود. برای نمونه محیطهای کشت ویولت رد بایل آگار (Violet Red bile Agar) که در آن کلیفرم‌ها کلنی‌های قرمز ایجاد می‌کند. محیط بریان گرین بایل آگار (Brilliant green bile Agar) که در آن کلیفرم‌ها کلنی قرمز ایجاد می‌کند و محیط لاکتوز براث (Lactose broth) که در آن کلیفرم‌ها تغییر رنگ و گاز ایجاد می‌کنند.

هیچ یک از محیط‌های بالا، به تنهایی قادر به جداسازی اشریشیا کلی (E. Coli) نیست. برای این منظور، باید از محیطها و روش‌های دیگر برای تکمیل آزمایش استفاده کرد.

۳- آزمایش و شمارش استرپتوکوک فکال (Faecal Streptococci): نحوه‌ی انجام آزمایش جستجو و شمارش استرپتوکوک نکال شبیه آزمایش کلیفرم است با این تفاوت که در آن از محیط‌های کشت گلوکز آزید براث (Glucose azid broth) قوی و معمولی (Single, Double Strength) استفاده می‌شود و به لوله دورهام نیازی نیست، چون استرپتوکوک فکال، گاز ایجاد نمی‌کند.

لوله‌های آزمایش تلقیح شده را به مدت ۷۲ ساعت در گرم خانه ℃۳۷ قرار داده، نتیجه را مشاهده می‌نماییم، در صورت رشد استرپتوکوک فکال در محیط، رنگ آن تغییر می‌کند. در ادامه‌ی آزمایش یک لوپ از لوله‌های رشد کرده را برداشته، به لوله آزمایش حاوی محیط کشت هانای و نرتون (Hannay and Norton’s Media) اضافه می‌نماییم و به مدت ۴۸ ساعت در اتو ℃۴۵ قرار می‌دهیم. ظاهر شدن رشد، دلیل آلودگی آب با استرپتوکوک نکال است، و با شمارش لوله‌های آزمایشی که در هر یک از رقتها در آنها رشد مشاهده شود، و با استفاده از جداول MPN مربوط می توان به تعداد احتمالی این باکتری در آب پی برد. البته تا این مرحله، آلودگی به استرپتوکوک فکال مشکوک است و برای تأیید باید به روشهای تکمیلی عمل شود.

۴- جستجو و شمارش کلستریدیوم پرفرنژان (Clostridium Perfringens, Welchii) یا ولشای: برای شناسایی این باکتری لازم است ابتدا نمونه‌ی آب تا حدود ℃۷۵ و به مدت ۱۰ دقیقه دما داده شود تا تمام فرم‌های رویشی باکتری‌ها از بین بروند و اسپرها باقی بمانند. سپس با رویشی کردن اسپرها به وسیله‌ی شوک دمایی، نسبت به شمارش و شناسایی آنها اقدام شود.

جدول ۱- ضریب تعداد حداکثر احتمالی با حدود ۹۵ درصد اطمینان

آزمایش میکروبی شیر مایع

برای شناسایی وضعیت آلودگی شیر مایع، راههای گوناگونی وجود دارد که زمان دسترسی به نتایج آنها متفاوت است. در بیشتر موارد بعد زمان در ارزیابی‌ها دارای اهمیت است و لازم است هرچه سریع تر نتیجه‌ی آزمایش مشخص شود تا از آلودگی بیشتر و معطل ماندن امکانات تولید جلوگیری به عمل آید. راه ساده و در عین حال سریعی که برای این منظور وجود دارد آزمایش احیای رنگ است، آزمایش احیای رنگ (Dye Reduction test) بر این اصل استوار است که میکروب‌های موجود در شیر با رشد و نمو خود مقداری از اکسیژن موجود در شیر را به مصرف رسانده، در نتیجه بر روی قدرت اکسیداسیون و احیای محیط (Redox) تأثیر می‌گذارند و با احیای مواد رنگی موجب تغییر رنگ محیط می‌گردند، این واکنش‌ها سریع است و راه ساده‌ای را برای تشخیص وضعیت میکروبی شیر در دسترس قرار می‌دهند. بدیهی است هر چه تعداد و فعالیت میکروب‌های موجود در شیر بیشتر باشد قدرت و ظرفیت اکسیداسیون و احیای (Oxidation Reduction Potantial (RH)) آن به میزان بیشتری کاهش می یابد و تغییر رنگ سریع تر اتفاق می افتد و برعکس.

این روش دارای مزایای زیر است:

 سهولت انجام

 سرعت عمل در دستیابی به نتیجه

 امکان انجام همزمان چند نمونه

 هزینه‌ی پایین انجام آزمایش

 عدم دخالت توده‌های میکروبی (Clump or Closter)

همزمان، معایبی به شرح زیر هم دارد:

 پاسخ به دست آمده مربوط به باکتری‌های هوازی است.

 دخالت مرحله رشد باکتری‌ها در نتیجه‌ی آزمایش

 متغیر بودن زمان تکثیر باکتری‌ها در طی آزمایش

 دخالت عوامل ضد میکروبی مانند آنتی بیوتیکها

 دخالت متغیرهایی مانند نور و مقدار چربی در آزمایش

آزمایش احیای رنگ با روشهای گوناگون قابل انجام است که متداول ترین آنها روش احیای رنگ متیلن بلو (Methylenblue Dye Reduction) است و مراحل انجام آن به شرح صفحه‌ی بعد است:

– تهیه محلول متیلن بلو: برای تهیه این محلول، لازم است ۲۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر سترون و گرم را در شیشه‌ی رنگی مناسب ریخته، یک عدد قرص متیلن بلوی استاندارد در آن انداخت. قرص‌های استاندارد متیلن بلو دارای ۱۹ میلیگرم رنگ متیلن بلوی استاندارد است.

پس از حل شدن قرص در آب مقطر، باید آن را در جای خنک و تاریک مانند یخچال قرار داد. محلول تهیه شده و نگهداری شده به روش بالا، تا حدود یک هفته قابل نگهداری است.

تهیه نمونه‌ی شیر مورد آزمایش: برای نمونه‌برداری از شیر مایع اول باید آن را به خوبی مخلوط نمود و سپس ۱۰ میلی‌لیتر از آن را در یک لوله آزمایش سترون شده ریخت. در اجرای دقیق تر آزمایش، لازم است پس از خالی شدن پیپت در آن دمی‌ده شود تا قطرات شیر چسبیده به جداره‌ی داخلی هم خارج گردد.

آزمایش‌های لازم: پس از آماده شدن نمونه، باید یک میلی‌لیتر از محلول متیلن بلو در آب مقطر به آن اضافه نموده، درب لوله آزمایش را با در لاستیکی مناسب بست و آن را به خوبی مخلوط نمود و در حمام آب گرم ℃ ۰/۵ ± ℃ ۳۷/۵ قرار داد و بلافاصله زمان را یادداشت نمود. باید دقت کرد که سطح آب بالاتر از سطح محتوای لوله‌ی آزمایش باشد. همزمان با تهیه‌ی نمونه اصلی لازم است یک لوله‌ی آزمایش حاوی ۱۰ میلی‌لیتر شیر بدون محلول متیلن بلو هم آماده کرده، و به جای محلول متیلن بلو یک میلی‌لیتر آب به آن اضافه نمود و به مدت سه دقیقه بجوشانید. سپس آن را سرد کرده، در حمام آب گرم، در مجاورت لوله آزمایش حاوی نمونه اصلی قرار داد و از این لوله برای مقایسه رنگ و زمان تغییر رنگ استفاده نمود. و پس از سپری شدن زمان های ۰/۵، ۱، ۱/۵، ۲، ۲/۵ و ۳ ساعت باید لوله‌ها را مشاهده و میزان تغییر رنگ را یادداشت نمود. در بیشتر موارد ته لوله آزمایش کمی‌دیرتر تغییر رنگ می‌دهد اما زمانی که رنگ قسمت بالای لوله آزمایش حاوی نمونه اصلی شبیه رنگ لوله‌ی آزمایش مشاهده شود، زمان ختم عمل فرا رسیده است.

گزارش نتیجه‌ی آزمایش: این کار، به صورت طبقه بندی نمونه‌های شیر براساس زمان سفید شدن رنگ و به عبارت دیگر، احیای رنگ انجام می‌شود. برای مثال، اگر پس از ۳۰ دقیقه رنگ زایل شود باید نوشته شود که زمان احیای رنگ متیلن بلو در مورد نمونه مربوط ۳۰ دقیقه است. و برای سایر نمونه‌ها هم به همین طریق گزارش شود تا از روی آن بتوان به نمونه هایی با آلودگی کم، زیاد یا متوسط و… پی برد.

البته از این روش نمی توان برای شمارش تعداد میکروب‌های موجود در شیر استفاده نمود.

آزمون فسفاتاز: از این روش نمی توان برای شمارش تعداد میکروب‌های موجود در شیر استفاده نمود.

جستجو و شمارش میکروب‌های موجود در شیر خشک

فرآیند تولید و بسته بندی شیر خشک به گونه‌ای است که کمتر امکان آلودگی شدید آن وجود دارد. با وجود این انحراف از معیارهای تولید و بسته بندی و توزیع، گاه موجب آلودگی می‌شود و چون از شیر خشک برای فرمول تهیه‌ی مواد غذایی فسادپذیر استفاده می‌شود، آلودگی احتمالی آن می تواند مشکل آفرین باشد. در چنین مواردی آزمایش میکروبی شیرخشک برای تأیید صلاحیت مصرف آن ضروری است.

– مراحل آزمایش میکروبی شیرخشک:

نمونه‌برداری: نمونه‌برداری از بهرهای بسته بندی شده باید با استفاده از روش استاندارد جمهوری اسلامی ایران به شماره ۲۸۳۶ یا جداول مناسب دیگر انجام گیرد، پس از انجام این مرحله می توان بسته‌ها را جداگانه مورد آزمایش میکروبی قرار داد و چنانچه انجام این کار به دلایلی مشکل باشد باید از تمام بسته هایی که به عنوان نمونه انتخاب شده اند نمونه‌برداری شود و نمونه‌ها با همدیگر مخلوط شده، پس از همگن شدن نمونه‌ی اولیه، نمونه‌ی مورد آزمایش از آن برداشته شود.

در مورد بهرهایی که به صورت فله هستند نمونه‌برداری باید از نقاط مرکزی و جوانب مختلف انجام گیرد و این نمونه‌ها با هم مخلوط شده، نمونه مورد آزمایش از آن انتخاب گردد. بدیهی است در هر مورد، نمونه‌برداری باید با ابزارهای سترون و شرایط بدون آلودگی دوباره انجام شود.

– آماده سازی محیط و محلول رقیق کننده:

تهیه‌ی محلول رقیق کننده: برای این آزمایش محلول رینگر مناسب تر است. برای تهیه این محلول، ۰/۹ گرم کلرور سدیم، ۰/۰۴۲ گرم کلرور پتاسیم، ۰/۰۴۸ گرم کلرور کلسیم هیدراته، ۰/۰۲ گرم بیکربنات سدیم و ۴۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر را باید بخوبی مخلوط کرده، در شیشه‌های مناسب یا به مقدار ۹ میلی‌لیتر به طور مستقیم در لوله‌های آزمایش ریخت و سترون نمود، به جای محلول بالا از محلول آب پیتونه با فردار هم می توان استفاده کرد.

تهیه محیط کشت: برای تهیه‌ی محیط‌های کشت نوترین آگار (Nutrient Agar) یا مولتن آگار (Multen Agar) که برای این منظور مناسب است، باید طبق روشهای متداول عمل شود.

– آماده سازی نمونه: برای آماده سازی نمونه لازم است ۲۵ گرم از آن را با ۲۲۵ میلی‌لیتر محلول رقیق‌کننده وارد مخلوط کن سترون شده کرد و بخوبی یکنواخت نمود. سپس از این مخلوط برای تهیه رقتها تا حدود ^۵-۱۰ استفاده کرد.

کشت دادن نمونه: برای این منظور ۴ شیشه یا لوله‌ی آزمایش، حاوی ۹ میلی‌لیتر محلول رقیق‌کننده را نشانه گذاری نموده (^۵-۱۰ تا ^۲-۱۰)؛ سپس به طریق سترون ۱ میلی‌لیتر از رقت اولیه‌ی تهیه شده و یکنواخت شده را به آنها اضافه کرد و سرانجام از هر یک از رقت‌های تهیه شده به روش بالا به وسیله پیپت استریل یک میلی‌لیتر برداشت و روی محیط کشت پلیتهای نشانه گذاری شده ریخته و با میله شیشه‌ای سترون، آن را به طور یکنواخت روی تمام سطح محیط کشت پلیتها پخش کرد و پلیتهای تلقیح شده را در دمای ℃۳۷ – ℃۳۱ قرار داد. پس از ۷۲ – ۲۴ ساعت پرگنه‌ها را شمارش نمود. برای دست یافتن به دقت بیشتر، بهتر است آزمایش دو بار تکرار شود.

این روش، روش شمارش کلی میکروب‌ها بر روی محیط آگار در پلیت است. به جای آن، می توان یک میلی‌لیتر از رقت‌های مورد نظر را به پلیت سترون افزود و روی آنها حدود ۱۰ تا ۱۵ میلی‌لیتر محیط سترون و ذوب شده در دمای حدود ℃۴۵ ریخت و پلیت و محتوای آن را پنج بار در هر یک از جهات (در جهت حرکت عقربه ساعت و خلاف جهت آن؛ به سمت چپ، سمت راست ؛ بالا و پایین) چرخاند تا میکروب‌های احتمالی موجود به طور یکنواخت در پلیت پخش شوند.

جستجوی باسیلوس سرئوس در برنج پخته

باسیلوس سرئوس، گونه‌ای باکتری مقاوم نسبت به گرمای هوازی و هوازی اختیاری، اسپر ساز، گرم مثبت، باسیل کوتاه با انتهای مربع شکل است که به صورت زنجیر کوتاه تا دراز دیده می‌شود. دمای مناسب برای رشد آن حدود ۳۰ تا ℃۳۷ است اما در دماهای ℃۴۵ تا ℃۵۰ هم قادر به ادامه‌ی زیست بدون تکثیر می باشد، a_w رشد آن بالاتر از ۰/۹۳ و pH مناسب برای رشد آن ۴/۹ تا ۹/۳ است، باکتری بسادگی تبدیل به اسپر می‌شود. اسپر بیضوی، میانی یا متمایل به کناری است که دیوارهای نازک دارد. مسمومیت‌های ناشی از این باکتری بیشتر بر اثر مصرف غذاهای پخته بویژه برنج که پس از پخت در شرایط جوانه زدن و رشد باکتری قرار گرفته باشند عارض می‌شود.

مراحل انجام آزمایش: محیط کشت مناسب برای کشت این باکتری فنل رد حاوی امولسیون زرده تخم مرغ و پلی میکسین (Phenol Red Egg – Yolk Polymy xine Agar) است که باید برابر دستور شرکت سازنده آماده گردد و امولسیون تخم مرغ و پلی میکسین به آن اضافه شود (طرز تهیه امولسیون تخم مرغ قبلا شرح داده شده است).

برای آماده کردن نمونه، ۲۵ گرم از آن را به مخلوط کن اضافه کرده، ۲۲۵ گرم محلول آب پپتونه با فردار سترون شده روی آن می‌ریزیم و با سرعت ۱۵۰۰۰ تا ۲۰۰۰۰ دور در دقیقه، بخوبی مخلوط و یکنواخت می‌کنیم، سپس مخلوط حاصل را تا ^۶-۱۰ رقیق کرده، از هر یک از رقت‌ها ۰/۲۵ میلی‌لیتر به دو پلیت حاوی محیط کشت فنل رد محتوای امولسیون زرده تخم مرغ و پلی میکسین اضافه کرده، با میله شیشه‌ای سترون بخوبی روی سطح پلیت پخش می‌کنیم و در گرمخانه ℃۳۰ قرار داده، ۲۴ ساعت بعد پرگنه‌های ظاهر شده روی سطح پلیت را میشماریم و در هر مورد میانگین پرگنه‌های روی دو پلیت را در عکس رقت آن ضرب می‌کنیم تا تعداد شمارش شود. لازم به یادآوری است که پرگنه‌های باسیلوس سرئوس روی محیط بالا به شکل گرد و سفید رنگ با هاله‌ای رسوب‌دار و کدر در زمینه‌ای به رنگ مایل به بنفش است.

برای تایید نتیجه، لازم است از پرگنه‌های مشخص و مجزا، یک لوپ کوچک برداشته رنگ آمیزی نمود و به دنبال آن آزمایش‌های بیوشیمیایی شامل احیای نیترات، هیدرولیز نشاسته مایع کردن ژلاتی، سنتز اسید از مانیتول و حرکت را انجام داد و از روی نتیجه به دست آمده قضاوت نهایی را اعمال کرد.

آزمایش‌های میکروبی آرد

مجموعه‌ی میکروبی آرد بسیار متنوع و متفاوت است. ماده اولیه‌ی آن (گندم در سالهای اخیر از نقاط مختلف دنیا وارد کشور می‌شود که آلودگی‌های مختلف مراکز تولید، نگهداری، حمل و نقل را به همراه دارد. برای تبدیل گندم به آرد گاهی آن را شست و شو می‌دهند و عمل مشروط کردن همیشه روی آن انجام می‌گیرد که مستلزم استفاده از مقدار زیادی آب است و این آب بر روی میزان آلودگی گندم تأثیر دارد. بنابراین مجموعه‌ی میکروبی آرد را فلور میکروبی اولیه و عوامل آلوده‌کننده، طی مراحل گوناگون شامل باکتریهای هوازی، هوازی اختیاری، بی هوازی اختیاری، اسپر سازهای کپک‌ها و مخمرها و سایر گونه‌های میکروب‌ها تشکیل می‌دهند.

شمارش میکروبی آرد: همواره شمارش میکروبی آرد با روش به کار رفته و محیط کشت مورد استفاده ارتباط دارد. برای نمونه، در یک بررسی که برای شمارش تعداد کل میکروب‌های زنده موجود در نوعی آرد صورت گرفت، شمارش روی محیط کشت نوترین آگار و دمای رشد ℃۳۷ حدود ۵۰% کمتر از شمارش میکروبی همان آرد روی محیط کشت نوترین ژلاتین و دمای رشد ℃۲۰ گزارش شد. بنابراین انتخاب روش باید به گونه‌ای باشد که کمترین خطا را به همراه داشته باشد، در هر حال مراحل انجام آزمایش به شرح زیر است:

۱- تهیه و آماده کردن محیط کشت: برای شمارش کلی تعداد میکروارگانیسم‌های موجود در آرد از محیط کشت دکستروز تریپتون آگار یا دکستروز تریپتون براث (Dextros Trypton Agar or Broth) استفاده می‌شود و برای جستجو و شمارش باکتری‌های بی هوازی از محیط تیو گیکلات براث یا محیط رینفور سد کلسترید بال. (Thioglycolate broth or Reinforced Clostridial Media (RCM))

محیط‌های کشت بالا را باید از پیش، به روش توصیه شده از سوی سازنده یا مراجع علمی تهیه، سترون و در پلیت‌ها و لوله‌ها به تناسب ریخت و برای مصرف آماده نمود.

۲- آماده کردن نمونه: برای آماده کردن نمونه لازم است پس از یکنواخت کردن بهر مورد نظر و نمونه‌ی برداشته شده از نقاط مختلف آن به روش استاندارد، ۱۰ گرم از آن را در ۹ میلی‌لیتر محلول رقیق‌کننده (محلول ۰/۱ درصد آب پپتونه سترون) ریخت و برای این که عمل یکنواخت کردن به شیوه‌ی مطلوب تری انجام گیرد. مقداری ماسه تمیز و سترون هم به محلول رقیق‌کننده و نمونه اضافه کرد و به مدت ۲۰ دقیقه مخلوط کن را روشن گذاشت تا تعداد بیشتری از باکتری‌ها و کپک‌های چسبیده به ذرات آرد جدا شوند. این کار در مورد آرد گندم لازم است، زیرا گونه هایی از باکتری‌های چسبیده به ذرات آرد که اپی فیتیک (Epiphitic) نامیده می‌شوند روی آرد رشد کرده، رطوبت مورد نیاز خود را از هوا و مواد غذایی مورد نیاز خود را از ذرات آرد می‌گیرند و در این وضعیت، به سادگی از آرد جدا نمی‌شوند، پس از مخلوط شدن نمونه و محلول رقیق کننده، سوسپانسیون حاصل را تا ^۴-۱۰ یا بیشتر (در صورت لزوم) رقیق کرده، بر روی رقت‌های به دست آمده، آزمایش‌های میکروبی زیر را انجام می‌دهیم.

شمارش کلی تعداد میکروب‌ها (Total Count): برای این آزمایش از محیط دکستروز تریپتون آگار و شمارش پر گنه‌ها و یا از محیط دکستروز تریپتون براث و کاربرد جداول MPN استفاده می‌کنیم. طبق معمول سه سری لوله آزمایش پنج تایی انتخاب می‌کنیم. به ۵ تای اول ۱۰ میلی لیتر، به ۵ تای دوم ۱ میلی‌لیتر و به ۵ تای سوم ۰/۱ میلی‌لیتر از رقت مورد نظر اضافه کرده، پلیتها و لوله‌های آزمایش را به مدت سه روز در گرمخانه ℃۳۲ قرار می‌دهیم و پس از آن به شمارش میکروبی اقدام می‌کنیم.

جستجوی باکتری‌های بی هوازی

برای این آزمایش از محیط کشت تیوگلیکلات براث یا RCM استفاده کرده، پلیتها و لوله‌های آزمایش را به مدت سه روز در شرایط بی هوازی و در دماهای ℃۲۵، ℃ ۳۷ و ℃ ۵۵ قرار می‌دهیم و پس از سپری شدن زمان لازم، شمارش را انجام می‌دهیم.

جداسازی اسپرها: در مورد جداسازی اسپرترموفیل‌ها (Thermo Phyl) از رقت ^۱-۱۰ استفاده نموده، دو لوله آزمایش دردار حاوی محیط کشت مناسب را تلقیح می‌کنیم و مدت ۱۵ دقیقه در حمام آب گرم ℃۸۰ قرار می‌دهیم و پس از طی این زمان، لوله‌ها را از حمام آب گرم خارج کرده، بسرعت سرد می‌کنیم و یک میلی‌لیتر از آن را در پلیت حاوی محیط کشت جامد یا لوله‌ی حاوی محیط کشت مایع ریخته، در گرمخانه با دمای ℃۳۷ قرار می‌دهیم. این آزمایش باید برای شرایط کشت بی هوازی تکرار شود.

در مورد جداسازی اسپرترمودوریک‌ها (Thermoduric) لازم است نمونه را به مدت ۵ دقیقه در حمام آب گرم با دمای ℃۱۰۰ قرار داد و بلافاصله سرد کرد و مانند روش بالا مراحل بعدی را ادامه داد.

جستجوی استافیلوکوک (Staphylococcus aureus) طلایی، کوآگولاز مثبت (Bacteriological filter): گونه‌های جنس استافیلوکوک، باکتری هایی هستند هوازی تا هوازی اختیاری بدون حرکت و دارای تجمع خوشه ای، توده ای، زنجیری کوتاه و کو کسی شکل و گرم مثبت، که نقش بسیار مهمی‌در مسمومیت‌های غذایی دارند، زیرا قادرند سموم و آنزیم‌های زیاد سنتز کرده، به وسیله‌ی آنها سلامت مصرف کنندگان فرآورده‌های غذایی را به خطر بیندازند.

این باکتری‌ها بسادگی بر روی دست و دهان و بینی رشد کرده، جزو فلور طبیعی این اندام‌ها هستند و از این طریق وارد مواد غذایی می‌شوند. این باکتری‌ها همچنین در هوا، خاک، آب، دستگاه گوارش نیز ممکن است وجود داشته باشند.

مواد غذایی ممکن است از یکی از رده‌های بالا آلوده شوند و بنابراین در صنایع غذایی آزمایش مواد اولیه، فرآورده‌های نهایی، اندام‌های کارکنان و سطوح در تماس با مواد غذایی از نظر آلودگی به این باکتری‌ها دارای اهمیت است.

از طرفی به تجربه ثابت شده است که بیش از ۶۰% از کارکنان واحدهای تولیدی و به طور کلی بیش از ۶۰% مردم، در اندام‌های خود باکتری استافیلوکوک طلایی را به طور طبیعی دارا هستند. بنابراین، افراد آلوده به این باکتری اگر در برابر مواد غذایی سرفه یا عطسه کرده، یا به مواد غذایی و ظروف و وسایل دست بزنند از این راه موجب آلودگی و مسمومیت می‌شوند، بنابراین لازم است کارکنان واحدهای تولید از نظر آلودگی به این باکتری مورد آزمایش قرار گیرند، تا چنانچه اندام هایشان به این باکتری آلوده است از کار آنها در محل هایی که تماس با مواد غذایی زیاد است جلوگیری شود.

به همین دلیل، لازم است، رده ساده‌ی تشخیص آلودگی اندام‌های کارکنان واحدهای تولیدی به این باکتری در دسترس و قابل اجرا باشد.

– جستجوی باکتری استافیلوکوک طلایی کوآگولاز مثبت در نقاط مختلف بدن

– مراحل انجام آزمایش: مراحل انجام آزمایش به شرح زیر است:

 – محیط کشت اختصاصی رشد این باکتری برد پارکر (Baird Parker Agar) است.

محیط کشت برد پار کر به صورت پودر آماده در دسترس است، که لازم است برابر دستور کار خانه سازنده آماده و سترون شود. هنگام کاربرد محیط سترون شده و زمانی که دمای آن حدود ℃۴۵ است باید مقداری امولسیون زرده‌ی تخم مرغ و تلوریت پتاسیوم (Pottasium tellurite, Egg – yolk tellurite) به آن اضافه شود. برای تهیه امولسیون تخم مرغ لازم است به تعداد نیاز، تخم مرغ تازه و سالم را مدتی حدود یک ساعت در الکل قرار داد تا پوسته‌ی خارجی آن سترون شود، بعد تخم مرغ را از الکل خارج کرده، در معرض هوا یا نزدیک شعله یا جای گرم قرار داد تا الکل باقیمانده بر روی پوسته تبخیر شود، سپس به وسیله‌ی پنس سترون انتهای آن را سوراخ کرده، به آرامی سفیده آن را خارج نمود و زردهی خالص را در ظرف مدرج سترون ریخت و معادل حجم آن، به آن سرم فیزیولوژی سترون اضافه نموده، به وسیله‌ی همزن شیشه‌ای یکنواخت کرد و به میزان ۵ درصد به محیط کشت آماده و سترون شده قبلی اضافه نمود.

همزمان برای تهیه محلول تلوریت پتاسیوم، لازم است یک گرم از آن را در شرایط عاری از آلودگی (Aseptic technique) وزن نموده، به ۱۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر سترون اضافه کرد و به خوبی به هم زد تا به طور کامل حل شود. سپس محلول را از روی صافی جداکننده‌ی میکروب (Bacteriological filter) عبور داد تا سترون شود. این محلول تا زمان مصرف باید در یخچال نگهداری شود و هنگام مصرف به میزان یک درصد به محیط اضافه گردد. پس از آماده شدن، سترون شدن و اضافه شدن امولسیون زرده‌ی تخم مرغ و تلوریت پتاسیوم و یکنواخت شدن محیط کشت آن را به مقدار ۱۰ تا ۱۵ میلی‌لیتر در پلیت‌های سترون ریخته، پلیت‌های حاوی محیط کشت سفت شده را به شکل وارونه در سبد مخصوص قرار داده سپس جهت استریل در داخل اتو کلاو گذاشته می‌شود تا برای مراحل بعدی آماده گردد.

– با پنبه‌ی سترون دسته‌دار (Swab) که در نوعی مایع رقیق‌کننده و از جمله لیتموس میلک (Litmus milk) یا آب پیتونه خیس شده است، اندام مورد نظر برای جستجوی باکتری را مرطوب کرده، چند بار بآرامی‌روی آن می‌مالیم تا باکتری‌های چسبیده به پوست جدا شده، به پنبه بچسبند (در مورد پوست دست لازم است پیش از انجام آزمایش، دست با آب ولرم شسته شود تا بار آلودگی آن کم شود.)

– پنبه‌ی دسته‌دار را که اکنون به باکتری‌های پوست دست آلوده شده، در شیشه‌ی دردار حاوی لیتموس میلک استریل انداخته، در شیشه را بخوبی می بندیم و چند بار بشدت تکان می‌دهیم، یا برای این منظور از دستگاه شیکر آزمایشگاهی استفاده می‌نماییم.

– پلیت‌های حاوی محیط کشت برد پار کر خشک شده به روش بالا را نشانه گذاری می‌نماییم.

– میکروب‌های جدا شده از پوست دست را تا ۳-۱۰ یا کمتر رقیق می‌کنیم.

– یک میلی‌لیتر از رقت‌های مورد نظر را روی محیط کشت برد پار کر ریخته، با میلهی شیشه‌ای ویژه، روی تمام سطح آگار به طور یکنواخت پخش می‌نماییم.

– پلیت‌های تلقیح شده را به صورت وارونه در اتو ℃۳۷ قرار می‌دهیم.

– پس از ۲۴ ساعت کلنیهای تشکیل شده روی سطح آگار را شمارش می‌کنیم. کلنیهای استافیلوکوک روی محیط بردپارکر به رنگ سیاه برآمده دارای حاشیه‌ی سفید نازک و اطراف روشن و پهن هستند. در برخی موارد به علت تغییرات امولسیون زرده تخم مرغ موجود در محیط، ممکن است اطراف کلنیها به جای رنگ روشن دارای رنگ مات شود و نتیجه آزمایش را مشکوک نماید، بنابراین لازم است آزمایش کوآگولاز هم انجام گیرد تا نتیجه‌ی به دست آمده تأیید شود.

– آزمایش کوآگولاز این آزمایش برای تشخیص باکتری استافیلوکوک طلایی که دارای قدرت بیماری زایی و مسمومیت زایی شدیدتری است انجام می‌گیرد. روش انجام آن به ترتیب زیر است :

– کلنیهای مجزا و مشکوک به استافیلوکوک کوآگولاز مثبت را به وسیله‌ی لوپ برداشته، به محیط کشت برین هارت اینفیوژن براث (Brain heart infusion broth) آماده و سترون شده اضافه می‌کنیم و به مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه ℃۳۷ قرار می‌دهیم.

– ۰/۳ میلی‌لیتر پلاسمای خون خرگوش را در لوله‌های آزمایش کوتاه ویژهی انجام این آزمایش می‌ریزیم.

– به لوله‌های آزمایش حاوی ۰/۳ میلی‌لیتر پلاسمای خون خرگوش، ۰/۱ میلی‌لیتر از محیط کشت برینهارت اینفیوژن برات اضافه کرده، در دمای ℃۳۷- ۳۵ قرار می‌دهیم.

– پس از ۴ ساعت لوله‌های آزمایش را مشاهده و نتیجه را گزارش می‌کنیم. نتیجه‌ی آزمایش برحسب مقدار انعقاد در لوله و به شرح شکل بالا انجام می‌گیرد.

بدیهی است آزمایشهای مواد غذایی از نظر آلودگی به این باکتری با همین روش انجام می‌گیرد و تنها تفاوت، در آماده کردن نمونه هاست.

شکل ۱

جستجو و شمارش سالمونلا (Salmonella) در گوشت مرغ

گونه‌های سالمونلا در خانواده¬ی آنتروباکتریاسه (Enterobacteriacae) قرار دارند، باکتری‌های این جنس گرم منفی، باسیلی شکل، بدون اسپر، هوازی و هوازی اختیاری و دارای حرکت هستند.

منشأ باکتری، دستگاه گوارش انسان و حیوانات به ویژه مرغ است. اما بر روی گیاهان هم زندگی می‌کند. دمای مناسب برای رشد آنها حدود ℃۳۷ است اما دماهای ۵/۵ تا ℃۴۵ را تحمل کرده، به رشد کند خود ادامه می‌دهد. سالمونلاها بیشتر از طریق آب آلوده، میوه‌ها و سبزیها، گوشت طیور، گوشت قرمز، تخم مرغ، شیر و اندامهای کسانی که با مواد غذایی سر و کار دارند منتقل می‌شوند و موجب عفونت و مسمومیت می‌گردند، گونه‌های سالمونلا در شرایط نامساعد قادر به رشد نیستند اما در شرایط مناسب با میکروب‌های دیگر رقابت کرده، شرایط محیط را به نفع خود تغییر می‌دهند و بسرعت رشد می‌کنند، در دمای بالا حساس هستند و در برابر دمای پاستوریزاسیون ظرف چند ثانیه نابود می‌شوند، اما اگر دما بخوبی به همه نقاط نرسد یا آلودگی دوباره رخ دهد امکان بروز و اشاعه‌ی عفونتها و مسمومیت‌های مربوط به صورت همه گیر وجود دارد.

جستجوی سالمونلا در مواد غذایی، کار بسیار مشکلی است و با روش‌های ساده و سریع، عملی نیست. اگر میکروب مدتی را در شرایط نامساعد مانند دمای بالا، سرما، شوک، خشکی و مانند اینها به سر برده باشد، قبل از آزمایش لازم است چند بار در محیطهای کشت تقویت‌کننده و غیر اختصاصی کشت داده شود تا شرایط فیزیولوژیک طبیعی خود را به دست آورد. در هر صورت جستجوی سالمونلا در مواد غذایی دارای چند مرحله به شرح زیر است

مرحله‌ی پیش از غنی سازی: برای این منظور، ابتدا حدود ۲۵ گرم از نمونه مورد آزمایش را در یک ظرف سترون ریخته، ۲۲۵ میلی‌لیتر لاکتوز برات ۰/۵ درصد یا سرم فیزیولوژی و یا محلول آب پپتونه با فردار به آن اضافه می‌کنیم و ظرف حاوی نمونه را به مدت ۲۴ تا ۱۸ ساعت در گرمخانه ℃ ۱ ± ۳۷ قرار می‌دهیم. بدیهی است چنانچه نمونه جامد باشد باید آن را در مخلوط کن سترون ریخته، یکنواخت نمود.

مرحله‌ی غنی کردن: در این مرحله دو نمونه ۲۵ گرمی از ماده غذایی مورد آزمایش را به طریق بدون آلودگی وزن کرده، به ظرف شیشه‌ای در‌دار با ظرفیتی حدود ۵۰۰ گرم منتقل می‌کنیم. سپس به یکی از آنها ۲۲۵ میلی‌لیتر تتراتیونات برات (Tetrathionate broth) و به دیگری همین مقدار سلنیت سیستئین برات (Selenit cystein broth) اضافه می‌نماییم. اگر مقدار چربی نمونه زیاد باشد بهتر است ۶ میلی‌لیتر محلول ۱۰% ترژیتول (Tergitol No.7) (سدیم هپتادسیل سولفات) به آن اضافه کنیم و پس از بستن در آن، محتویات بسته را بشدت به هم زده، به مدت ۲۴ ساعت در اتو ℃۳۵۲ قرار دهیم. دمای مناسب برای این مرحله را برخی از محققان تا ℃۴۳ ذکر کرده اند. استفاده از محیطهای غنی‌کننده‌ی اختصاصی و دمای بالا از رشد باکتریهای رقیب جلوگیری و محیط را به نفع گونه‌های سالمونلا مساعد می‌کنند.

در صورت جامد بودن نمونه، لازم است از مخلوط کن و یکنواخت‌کننده‌ی مناسب با دور ۱۵۰۰۰ تا ۲۰۰۰۰ استفاده شود.

مرحله‌ی کشت روی پلیت: برای اجرای این مرحله یک لوپ (Loop) پر از کشت مرحله بالا را برداشته، روی محیطهای سالمونلا شیگلا آگار (Salmonella Shigella Agar (SSA))، بیسمومت سولفیت آگار (Bismuth sulphite Agar (BSA))، بریان گرین آگار (Brilliant green Agar (BGA)) کشت می‌دهیم. به نحوی که در صورت حضور سالمونلا در قسمتی از پلیت کلنیهای مجزا تشکیل شود. پلیت‌ها را به مدت ۲۲ تا ۲۴ ساعت در گرمخانه ℃ ۱ ± ۳۵ قرار می‌دهیم. پرگنه‌های سالمونلا روی محیط کشت سالمونلا شیگلا آگار معمولا بیرنگ است.

اما ممکن است پرگنه‌های قهوه‌ای روشن، صورتی روشن یا زرد هم تشکیل شود، پرگنه‌ها در شرایط نامساعد رشد و بعد از ۲۴ ساعت، حدود ۵ میلی‌لیتر یا بیشتر خطر دارند و مرکز آنها ممکن است به رنگ تیره باشد. روی محیط بریان گرین آگار پرگنه‌های سالمونلا دارای رنگ صورتی یا قرمز شبیه رنگ فوشین هستند.

مرحله‌ی تشخیص: برای تشخیص نهایی لازم است از هر یک از محیط‌های کشت SSA ، BSA و BGA پنج پرگنه مشخص و مشکوک را از روی سطح آگار برداشته، در عمق و روی سطح محیط تریپل شوگر آیرون آگار (Tr p esugar Iron Agar (TSI)) که به صورت خوابیده در لوله آزمایش قرار دارد، کشت داد. و در گرمخانه ℃ ۲ ± ۳۵ گذاشت. در صورت رشد سالمونلا در محیط TSI در قسمت شیب‌دار آن رنگ مایل به ارغوانی ایجاد می‌شود که مربوط به قلیایی شدن محیط است. در قسمت میانی محیط، بر اثر اسیدی شدن آن، رنگ زرد حاصل می‌شود. قسمت عمقی محیط هم به علت سنتز SH_۲ تیره رنگ می‌شود. (پاره‌ای از گونه‌های سالمونلا SH2 سنتر نمی‌کنند.)

مرحله‌ی تأیید: در این مرحله، ابتدا با مقداری از محیط TSI که باکتری روی آن رشد کرده، مقداری سرم فیزیولوژی یک سوسپانسیون میکروبی تهیه می‌کنیم و بعد آن را با یک قطره سرم پلی والان مخلوط کرده، با چشم غیرمسلح تشکیل یا تشکیل نشدن لخته و انعقاد را مشاهده می‌نماییم. برای این منظور، از درشت نمایی ۱۰ تا ۴۰ برابر هم می توان استفاده کرد و بهتر است یک الام شاهد هم تهیه شود.

برای تعیین سروتیپ‌های سالمونلا، مراحل تخصصی دیگری هم باید انجام شود که مربوط به سازمان‌های تخصصی مربوط است.

آزمایش میکروبی ماهی‌های آب شور

ماهی، از فسادپذیرترین مواد غذایی، و مسمومیت‌ها و عفونت‌های حاصل از مصرف ماهی آلوده و فاسد، از بزرگ ترین و شدیدترین عارضه‌های میکروبی است. آلودگی ماهی از راه‌های گوناگون مانند محیط زیست، ابزارهای صید، وسایل حمل و نقل و نگهداری، اندام‌های کارکنان و موارد مشابه انجام می‌گیرد، از طرفی pH ماهی، رطوبت آن و فعالیتهای آنزیمی آن به گونه‌ای است که شرایط بسیار مناسبی برای رشد عوامل آلوده‌کننده ایجاد می‌کنند. به علت شوری آب دریا و پایین تر بودن دمای آب نسبت به ساحل، آلودگی‌های اولیه ماهی بیشتر از نوع باکتری‌های نمک دوست و سرمادوست است. بنابراین برای انجام آزمایش میکروبی، نیاز به تکنیک‌های ویژه است.

نمونه‌برداری و آماده کردن نمونه: نمونه‌برداری ممکن است از نقاط مختلف بدن ماهی انجام گیرد، برای مثال، نمونه‌برداری از سطح بدن ماهی، به چند شکل زیر انجام می‌شود: یکی روش شست وشوی سطح بدن ماهی است (Rinse Method) که برای ماهی درسته با شکم خالی یا پر و با وزن کمتر از ۲ کیلوگرم یا فیله ماهی انجام می‌گیرد. برای این منظور ابتدا با ابزارهای مناسب پولکهای ماهی را جدا کرده، نمونه را در کیسه نایلونی محکم و سترون قرار می‌دهیم و ۵۰۰ میلی‌لیتر محلول ۰/۱ درصد آب پپتونه سترون به آن اضافه نموده تا سر حد امکان هوای کیسه را خالی می‌کنیم. آن گاه، برای مدت دو دقیقه آن را بشدت ماساژ داده، تکان می‌دهیم. در این مرحله تمام سطح بدن ماهی باید ماساژ داده شود تا میکروب‌های تمام قسمت‌های سطح بدن ماهی جدا شود. پس از این عمل مایع رقیق‌کننده را به ظرف اولیه آن برگردانده، آن را تا ^۴-۱۰ یا حد دلخواه رقیق می‌کنیم و مورد آزمایش‌های لازم قرار می‌دهیم.

در صورتی که هدف، جداسازی سالمونلا باشد لازم است به جای محلول رقیق‌کننده بالا از محلول رقیق‌کننده‌ی آب پیتونه ۱% با فردار استفاده شود.

– روش نمونه‌برداری با پنبه سترون دسته دار (Swab Method): در این روش یک پنبه سترون از جنس آلژینات کلسیم را در محلول رقیق‌کننده خیس کرده، بخوبی روی سطحی معادل ۱۰ سانتیمتر مربع از بدن ماهی بمالید. سپس پنبه‌ی دسته‌دار را وارد لوله‌ی آزمایش حاوی مایع رقیق‌کننده کرده، از حدود ۰/۵ سانتیمتری بالای قسمت پنبه پیچ شده بشکنید و پس از ورود آن به داخل محلول رقیق کننده، حدود ۵۰ بار آن را بشدت تکان دهید. (برای این منظور می توانید از تکان دهنده‌ی الکتریکی استفاده کنید. بعد تا حد دلخواه رقیق می‌نماییم.

– نمونه‌برداری از گوشت عضله ماهی

روش اول: در این روش، قسمتی از سطح بدن ماهی را با صفحه‌ی فلزی داغ سترون نموده ، ابعاد معینی از آن را (برای نمونه طول و عرض ۴ و عمق ۲ سانتی متر) بریده، وارد محلول رقیق‌کننده می‌کنیم و به وسیله‌ی مخلوط کن برقی آن را یکنواخت کرده، از آن نمونه بر می‌داریم.

روش دوم: در این روش، سطح بدن ماهی را به وسیله‌ی پنبه دسته‌دار خیس شده در الکل سترون کرده یا مقداری الکل روی آن ریخته، آتش می زنیم. بدین ترتیب بدون داغ شدن گوشت ماهی سطح آن سترون می‌شود. سپس قسمتی از آن را، به طول و عرض ۴ و عمق ۲ سانتی متر، بریده، داخل محلول رقیق‌کننده ریخته، به وسیله‌ی مخلوط کن برقی یکنواخت می‌کنیم. بدیهی است چنانچه شمارش تعداد مطرح باشد، مقدار وزنی عضله زیر پوست و مقدار محلول رقیق‌کننده باید ۲۵ و ۲۲۵ میلی‌لیتر باشد و با روش‌های معمول رقتهای لازم تهیه شود. محلول‌های رقیق‌کننده برای جست و جوی میکروارگانیسم‌های مختلف متفاوت است و به شرح زیر پیشنهاد می‌شود:

– برای جست و جوی سالمونلا محلول ۱% آب پپتونه با فردار

– برای جست و جوی ویبرید پارا همولیتیکوس محلول ۳% کلرور سدیم

– برای سایر موارد محلول ۱/۰ درصد آب پپتونه با فردار یا محلول رینگر

آزمایش‌های لازم: شمارش میکروارگانیسم‌های سطح عضله، امعا و احشا، به تفکیک و روی محیط‌های خاص آنها باید انجام شود.

– تعداد کل میکروب‌های زنده با استفاده از محیط کشت پلیت کانت آگار

– شمارش میکروب‌های تحمل‌کننده‌ی نمک (Halophiles) با استفاده از محیط کشت پلیت گانت آگار به اضافه ۱۵% کلرور سدیم که برای این دسته از میکروارگانیسم محلول رقیق‌کننده هم محلول ۳% کلرور سدیم است.

– شمارش کلیفرم‌ها با استفاده از محیط کشت مک کونکی، لوریل تریپتون برات و روش Dilution tube count، مناسب تر است.

– جستجو و شمارش گونهی استافیلوکوک طلایی با استفاده از محیط برد پار کر یا محیطهای اختصاصی دیگر.

– جستجو و شمارش کلستریدیوم پرفرنژان یا ولشای با استفاده از محیط کشت تریپتوز سولفیت سیکلوسرین آگار دولایه، که در این مورد ابتدا یک لایه از محیط کشت حاوی امولسیون زرده تخم را در پلیت ریخته، سپس یک میلی‌لیتر از رقت مورد نظر را روی آن به طور یکنواخت پخش می‌کنیم و روی این قسمت یک لایه محیط کشت بدون امولسیون زرده تخم مرغ اضافه می‌کنیم و پلیت‌ها را در شرایط بی هوازی مانند جار بی هوازی قرار می‌دهیم و سرانجام جار حاوی پلیت‌های آماده شده به مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه ℃۳۷ قرار داده، پس از طی این زمان پرگنده‌های حاصل را مشاهده می‌کنیم، پرگنههای کلستریدیوم ولشای روی این محیط به رنگ سیاه و با هاله سفید مات احاطه شده است.

در صورت دسترسی نداشتن به محیط بالا می توان از محیط تیوگلیکولات استفاده نمود. این محیط دارای تیوگلیکولات سدیم است که ماده‌ای است احیاکننده‌ی قوی، و اکسیژن محیط را جذب کرده، آن را بی هوازی یا حداقل بی هوازی اختیاری می‌کند که برای رشد باکتری مناسب است.

دمای مناسب برای اتو گذاری پلیت‌ها و لوله‌های آزمایشگاهی ۵، ۱۵، ۲۵ و ۳۷ درجه سانتیگراد برای رشد باکتری‌های سرمادوست، مزوفیل و گرما دوست است.

آزمایش میکروبی کمپوت و کنسرو

انجام آزمایش‌های میکروبی کمپوت‌ها و کنسروها، شامل مراحل زیر است:

اتوگذاری مقدماتی (Pre – Incubation): در این مرحله دو سری از نمونه‌ی قوطیهای کنسرو انتخاب شده با روشهای آماری درست را برداشته، یک سری از آنها را به مدت یک هفته در دمای ℃۳۷ – ۳۳ قرار می‌دهیم تا در صورت آلودگی احتمالی، میکروب‌ها رشد کرده، تعداد آنها به حد لازم برای شناسایی برسد. بدیهی است چنانچه نمونه قوطی‌ها متورم باشند نیازی به این مرحله نیست. (مگر اینکه علت تورم، وجود گاز میکروبی نباشد.) سری دوم نمونه‌ها را لازم است برای آزمایشهای تأییدی نگهداری نمود.

باز کردن قوطی‌های کنسرو به منظور انجام آزمایش‌های میکروبی: برای این منظور، سر یا ته قوطی مورد نظر را با پنبه خیس شده در الکل سترون نموده، مقدار کمی (حدود ۱ میلی لیتر) الکل روی آن می‌ریزیم و پس از مدت کوتاهی آن را آتش می زنیم تا الکل تبخیر شود، سپس با درب باز کن دوار استریل، سوراخی با حداقل قطر بر روی در قوطی ایجاد نموده، چنانچه محتویات قوطی مایع است، به وسیله‌ی پیپت سترون، مقداری از آن را بر می‌داریم و در صورت نیاز رقیق نموده، در غیر این صورت، به طور مستقیم به محیط کشت منتقل می‌نماییم.

چنانچه محتوای قوطی جامد باشد باید از قسمتهای مختلف آن نمونه‌برداری شود، به طوری که نمونه گزینش شده معرف خوبی از کل محتوای بسته باشد. در مواردی که آلودگی مشهود نیست حداقل ۲۵ گرم از نمونه باید با ماده رقیق‌کننده رقیق شده، رقت‌های بعدی از آن آماده شود.

باز کردن درب قوطی‌های باد کرده: در مورد قوطی‌های باد کرده، نمونه‌برداری باید به صورت زیر انجام گیرد:

ابتدا یک تشت انتخاب نموده، مقداری آب حاوی مواد ضدعفونی‌کننده در آن می‌ریزیم بعد سطح قوطی مورد نظر برای آزمایش را به روش بالا سترون نموده، روی آن یک قیف سترون متناسب با قطر قوطی قرار می‌دهیم (قطر دهانه قیف باید بیشتر از قطر قوطی باشد). بعد از سوراخ قیف یک میله‌ی نوک تیز یا میخ نوک تیز سترون وارد کرده، به وسیله‌ی چکش یا ابزار مناسب دیگر روی در را سوراخ می‌کنیم تا گازهای قوطی خارج شود. در این مرحله، لازم است قوطی طوری نگه داشته شود که محتوای آن از راه سوراخ قیف به بیرون پرت نشود و براحتی به داخل تشت بریزد. پس از این عمل، مانند روش بالا، بر روی در قوطی سوراخ کوچکی ایجاد نموده، از راه آن نمونه‌برداری را انجام می‌دهیم.

آزمایش‌های پیشنهادی:

– شمارش مستقیم میکروسکوپی: آزمایش عمومی، برای انجام این آزمایش از شش سری محیط کشت دکستروزتریپتون آگار (Dextrose trypton Agar) با معرف پرمو کرازول ارغوانی استفاده کرده، پلیت‌های تلقیح شده (Inoculated) را در دماهای ℃۲۵ – ۲۲ و ℃۳۷ – ۳۵ و ℃۶۰ – ۵۵ به صورت هوازی و بی هوازی به مدت ۳۶-۲۴ ساعت در گرمخانه می‌گذاریم و پس از طی این مدت، پرگنه‌های تشکیل شده را مورد مراحل شناسایی بعدی قرار می‌دهیم.

– شمارش و شناسایی اسپرها: برای این آزمایش از دو سری از رقت‌های تهیه شده در لوله آزمایش در‌دار یا شیشه مک کارتنی در پیچی را یکی به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ℃۸۰ و دیگری ۵ دقیقه در دمای ℃۱۰۰ قرار می‌دهیم و پس از سرو نمودن تدریجی به محیط کشت اختصاصی منتقل می‌نماییم، همچنین برای اسپر گونه‌های کلستریدیوم (Clostridia) از محیط (Sulphit polymyxine sulphadiazin) SPS و برای گونه‌های باسیلوس از محیط تریپتون سوی براث (Trypton soy broth) استفاده می‌نماییم.

– برای جستجوی کلستریدیاها از محیط‌های کشت آگار خون دار با نئومایسین (Blood Agar with Neomycine) SPS، روبرتسون کوکدمیت (Robertson cooked Meat Media)، لیور براث (Liver broth)، تیو گلیکولات براث (Thioglycolate broth) و قرار دادن لوله‌ها و پلیت‌های تلقیح شده در شرایط بی هوازی استفاده می‌شود.

– برای جستجوی گونه‌های باسیلوس، از محیط کشت TSB استفاده می‌شود.

– برای جستجوی کلیفرم‌ها از محیطهای لوریل تریپتون براث (Lauryl trypton broth)، مک کانکی (Mac. Conkey) یا وایولت رد بایل آگار (Violet Red bile Agar) استفاده می‌شود.

– برای جستجوی مخمرها و کیکها از محیط مالت اکستراکت آگار (Malt Extract Agar) با محیط مایکولوژیکی (Mycological Media) استفاده می‌شود.

خودآزمایی

١- شمارش هر یک از موارد تعداد کل میکروب‌های زنده، کلیفرم ها، استرپتوکوک فعال و کلستریدیوم پرفرنژان یا ولشای در آب، به چه منظور انجام می‌گیرد؟

۲- محاسن آزمایش احیای رنگ برای شناسایی وضعیت آلودگی شیر را بنویسید.

۳- آماده کردن نمونه باسیلوس سرئوس چگونه انجام می‌گیرد؟

۴- مجموعه‌ی میکروبی آرد را نام ببرید.

۵- جداسازی اسپرها در آزمایش میکروبی آرد چگونه انجام می‌شود؟

۶- مرحله غنی سازی در آزمایش سالمونلا را شرح دهید.

۷- نمونه‌برداری از بدن ماهی به چند طریق انجام می‌گیرد؟ توضیح دهید.

۸- نمونه‌برداری از قوطی‌های باد کرده چگونه انجام می‌شود؟