علوم اعصاب پروس؛ ترانسپورترها و کانال‌های یونی

Overview

THE GENERATION OF ELECTRICAL SIGNALS in neurons requires that plasma membranes establish concentration gradients for specific ions and that these membranes undergo rapid and selective changes in their permeability to these ions. The membrane proteins that create and maintain ion gradients are called active transporters; other proteins, called ion channels, give rise to selective ion permeability changes. Ion channels are transmembrane proteins that contain a narrow pore that selectively permits particular ions to permeate the membrane. Some ion channels also contain voltage sensors that are able to detect the electrical potential across the membrane. Such voltage-gated channels open or close in response to the magnitude of the membrane potential, allowing the membrane’s permeability to be regulated by changes in this potential. Other types of ion channels are gated by chemical signals, either by extracellular signals such as neurotransmitters or by intracellular signals such as second messengers. Still other channels respond to mechanical stimuli, temperature changes, or a combination of signals. Different combinations of ion channels are found in different cell types, yielding a wide spectrum of electrical characteristics. In contrast to ion channels, active transporters are membrane proteins that produce and maintain ion concentration gradients. The most important of these is the Na⁺ pump, which hydrolyzes ATP to regulate the intracellular concentrations of both Na⁺ and K⁺. Other active transporters produce concentration gradients for the full range of physiologically important ions, including Cl^–, Ca²⁺, and H⁺. From the perspective of electrical signaling, active transporters and ion channels are complementary: Transporters create the concentration gradients that help drive ion fluxes through open ion channels, thereby generating electrical signals.

مرور کلی

تولید سیگنال‌های الکتریکی در نورون‌ها مستلزم آن است که غشاهای پلاسمایی برای یون‌های خاص، گرادیان غلظت ایجاد کنند و این غشاها تغییرات سریع و انتخابی در نفوذپذیری خود نسبت به این یون‌ها داشته باشند. پروتئین‌های غشایی که گرادیان‌های یونی را ایجاد و حفظ می‌کنند، ناقل‌های فعال نامیده می‌شوند؛ پروتئین‌های دیگر، به نام کانال‌های یونی، باعث تغییرات نفوذپذیری انتخابی یون می‌شوند. کانال‌های یونی، پروتئین‌های غشایی هستند که حاوی یک منفذ باریک هستند که به طور انتخابی به یون‌های خاص اجازه نفوذ به غشا را می‌دهد. برخی از کانال‌های یونی همچنین حاوی حسگرهای ولتاژ هستند که قادر به تشخیص پتانسیل الکتریکی در سراسر غشا هستند. چنین کانال‌های وابسته به ولتاژ در پاسخ به بزرگی پتانسیل غشا باز یا بسته می‌شوند و اجازه می‌دهند نفوذپذیری غشا با تغییرات در این پتانسیل تنظیم شود. انواع دیگر کانال‌های یونی توسط سیگنال‌های شیمیایی، یا توسط سیگنال‌های خارج سلولی مانند انتقال‌دهنده‌های عصبی یا توسط سیگنال‌های درون سلولی مانند پیام‌رسان‌های ثانویه، دریچه‌دار می‌شوند. کانال‌های دیگر نیز به محرک‌های مکانیکی، تغییرات دما یا ترکیبی از سیگنال‌ها پاسخ می‌دهند. ترکیبات مختلفی از کانال‌های یونی در انواع مختلف سلول یافت می‌شوند که طیف وسیعی از ویژگی‌های الکتریکی را به همراه دارند. برخلاف کانال‌های یونی، ناقل‌های فعال، پروتئین‌های غشایی هستند که گرادیان‌های غلظت یون را تولید و حفظ می‌کنند. مهم‌ترین آنها پمپ ⁺Na است که ATP را هیدرولیز می‌کند تا غلظت‌های درون سلولی ⁺Na و ⁺K را تنظیم کند. سایر ناقل‌های فعال، گرادیان‌های غلظت را برای طیف کاملی از یون‌های مهم فیزیولوژیکی، از جمله ⁺Cl^–، Ca² و ⁺H، تولید می‌کنند. از منظر سیگنالینگ الکتریکی، ناقل‌های فعال و کانال‌های یونی مکمل یکدیگر هستند: ناقل‌ها گرادیان‌های غلظتی را ایجاد می‌کنند که به هدایت جریان‌های یونی از طریق کانال‌های یونی باز کمک می‌کنند و در نتیجه سیگنال‌های الکتریکی تولید می‌کنند.

lon Channels Underlying Action Potentials

Although Hodgkin and Huxley had no knowledge of the physical nature of the conductance mechanisms underlying action potentials, they nonetheless proposed that nerve cell membranes have channels that allow ions to pass selectively from one side of the membrane to the other (see Chapter 3). Based on ion conductances and currents measured in voltage clamp experiments, the postulated channels had to have several properties. First, because the ion currents are quite large, the channels had to be capable of allowing ions to move across the membrane at high rates. Second, because the currents depend on the electrochemical gradient across the membrane, the channels had to make use of these gradients. Third, because Na⁺ and K⁺ flow across the membrane independently of each other, different channel types had to be capable of discriminating between Na⁺ and K⁺, allowing only one of these ions to flow across the membrane under the relevant conditions. Finally, given that the ion conductances are voltage-dependent, the channels had to be able to sense the membrane potential, opening only when the voltage reached appropriate levels. While this concept of channels was highly speculative in the 1950s, later experimental work established beyond any doubt that transmembrane proteins called voltage-sensitive ion channels indeed exist and are responsible for action potentials and other types of electrical signals.

کانال‌های زیرین پتانسیل‌های عمل

اگرچه هاچکین و هاکسلی هیچ دانشی از ماهیت فیزیکی مکانیسم‌های رسانایی زیربنای پتانسیل‌های عمل نداشتند، با این وجود پیشنهاد کردند که غشاهای سلول‌های عصبی کانال‌هایی دارند که به یون‌ها اجازه می‌دهند به صورت انتخابی از یک طرف غشا به طرف دیگر عبور کنند (به فصل 3 مراجعه کنید). بر اساس رسانایی‌های یونی و جریان‌های اندازه‌گیری شده در آزمایش‌های گیره ولتاژ، کانال‌های فرضی باید چندین ویژگی داشته باشند. اول، از آنجا که جریان‌های یونی بسیار بزرگ هستند، کانال‌ها باید قادر به اجازه دادن به یون‌ها برای حرکت در سراسر غشا با سرعت بالا باشند. دوم، از آنجا که جریان‌ها به گرادیان الکتروشیمیایی در سراسر غشا بستگی دارند، کانال‌ها باید از این گرادیان‌ها استفاده کنند. سوم، از آنجا که ⁺Na و ⁺K به طور مستقل از یکدیگر در سراسر غشا جریان می‌یابند، انواع مختلف کانال‌ها باید قادر به تمایز بین ⁺Na و ⁺K باشند و تنها به یکی از این یون‌ها اجازه دهند در شرایط مربوطه از غشا جریان یابد. در نهایت، با توجه به اینکه رسانایی‌های یونی وابسته به ولتاژ هستند، کانال‌ها باید بتوانند پتانسیل غشا را حس کنند و تنها زمانی باز شوند که ولتاژ به سطوح مناسب برسد. اگرچه این مفهوم کانال‌ها در دهه ۱۹۵۰ بسیار گمانه‌زننده بود، اما کارهای تجربی بعدی بدون هیچ شکی ثابت کرد که پروتئین‌های غشایی به نام کانال‌های یونی حساس به ولتاژ واقعاً وجود دارند و مسئول پتانسیل‌های عمل و سایر انواع سیگنال‌های الکتریکی هستند.

BOX  4A    ◊  The Patch Clamp Method

Awealth of information about the function of ion channels has resulted from the invention of the patch clamp method. This technique is based on a very simple idea. A glass pipette with a very small opening is used to make tight contact with a tiny area, or patch, of neuronal membrane. After the application of a small amount of suction to the back of the pipette, the seal between the pipette and membrane becomes so tight thatno ions can flow between the pipette and the membrane. Thus, all the current that flows when a single ion channel opens must flow into the pipette. This minute electrical current can be measured with an ultrasensitive electronic amplifier connected to the pipette. This arrangement is the cell-attached patch clamp recording method. As with the conventional voltage clamp method, the patch clamp method allows experimental control of the membrane potential to characterize the voltage dependence of membrane currents.

جعبه ۴A    ◊  روش گیره وصله

اطلاعات فراوانی در مورد عملکرد کانال‌های یونی از اختراع روش گیره وصله حاصل شده است. این تکنیک بر اساس یک ایده بسیار ساده است. یک پیپت شیشه‌ای با دهانه بسیار کوچک برای ایجاد تماس محکم با یک ناحیه کوچک یا وصله از غشای نورونی استفاده می‌شود. پس از اعمال مقدار کمی مکش به پشت پیپت، آب‌بندی بین پیپت و غشا آنقدر محکم می‌شود که هیچ یونی نمی‌تواند بین پیپت و غشا جریان یابد. بنابراین، تمام جریانی که هنگام باز شدن یک کانال یونی جریان می‌یابد، باید به داخل پیپت جریان یابد. این جریان الکتریکی کوچک را می‌توان با یک تقویت‌کننده الکترونیکی فوق حساس متصل به پیپت اندازه‌گیری کرد. این روش، روش ثبت گیره وصله متصل به سلول است. همانند روش گیره ولتاژ مرسوم، روش گیره وصله امکان کنترل تجربی پتانسیل غشا را برای توصیف وابستگی ولتاژ جریان‌های غشا فراهم می‌کند.

Minor manipulations allow other recording configurations. For example, if the membrane patch within the pipette is disrupted by briefly applying strong suction, the interior of the pipette becomes continuous with the cell cytoplasm. This arrangement allows measurements of electrical potentials and currents from the entire cell and is therefore called whole-cell recording. The whole-cell configuration also allows diffusional exchange between the solution in the pipette and the cytoplasm, producing a convenient way to inject substances into the interior of a “patched” cell.

دستکاری‌های جزئی امکان ثبت‌های دیگری را فراهم می‌کنند. به عنوان مثال، اگر وصله غشایی درون پیپت با اعمال مکش قوی به طور مختصر پاره شود، فضای داخلی پیپت با سیتوپلاسم سلول پیوسته می‌شود. این چیدمان امکان اندازه‌گیری پتانسیل‌ها و جریان‌های الکتریکی از کل سلول را فراهم می‌کند و بنابراین ثبت کل سلول نامیده می‌شود. پیکربندی کل سلول همچنین امکان تبادل انتشاری بین محلول درون پیپت و سیتوپلاسم را فراهم می‌کند و راهی مناسب برای تزریق مواد به داخل یک سلول «وصله‌گذاری شده» ایجاد می‌کند.

Two other variants of the patch clamp method originate from the finding that once a tight seal has formed between the membrane and the glass pipette, small pieces of membrane can be pulled away from the cell without disrupting the seal; this yields a preparation that is free of the complications imposed by the rest of the cell. Simply retracting a pipette that is in the cell-attached configuration causes a small vesicle of membrane to remain attached to the pipette. By briefly exposing the tip of the pipette to air, the vesicle opens to yield a small patch of membrane with its (former) intracellular surface exposed. This arrangement, called the inside-out patch recording configuration, makes it possible to change the medium to which the intracellular surface of the membrane is exposed. Thus, the inside-out configuration is particularly valuable when studying the influence of intracellular molecules on ion channel function.

دو نوع دیگر از روش گیره وصله از این یافته ناشی می‌شوند که پس از تشکیل یک آب‌بندی محکم بین غشا و پیپت شیشه‌ای، می‌توان قطعات کوچک غشا را بدون از بین بردن آب‌بندی از سلول جدا کرد. این روش، آماده‌سازی‌ای را ایجاد می‌کند که عاری از عوارض ناشی از بقیه سلول است. به سادگی جمع کردن پیپتی که در پیکربندی متصل به سلول قرار دارد، باعث می‌شود یک وزیکول کوچک غشا به پیپت متصل بماند. با قرار دادن مختصر نوک پیپت در معرض هوا، وزیکول باز می‌شود و یک وصله کوچک غشا با سطح (قبلی) درون سلولی آن ایجاد می‌شود. این چیدمان که پیکربندی ضبط پچ از داخل به خارج نامیده می‌شود، امکان تغییر محیطی را که سطح درون سلولی غشاء در معرض آن قرار دارد، فراهم می‌کند. بنابراین، پیکربندی از داخل به خارج به ویژه هنگام مطالعه تأثیر مولکول‌های درون سلولی بر عملکرد کانال یونی ارزشمند است.

Alternatively, if the pipette is retracted while it is in the whole-cell configuration, the membrane patch produced has its extracellular surface exposed. This arrangement, called the outside-out recording configuration, is optimal for studying how channel activity is influenced by extracellular chemical signals such as neurotransmitters (see Chapter 5). This range of possible configurations makes the patch clamp method an unusually versatile technique for studies of ion channel function. Robotic versions of the patch clamp technique have made their way into industry, serving as a very sensitive and rapid means of screening therapeutic drugs that act on ion channels.

از طرف دیگر، اگر پیپت در حالی که در پیکربندی کل سلول قرار دارد، جمع شود، سطح خارج سلولی پچ غشایی تولید شده نمایان می‌شود. این چیدمان که پیکربندی ضبط خارج به خارج نامیده می‌شود، برای مطالعه چگونگی تأثیر فعالیت کانال توسط سیگنال‌های شیمیایی خارج سلولی مانند انتقال‌دهنده‌های عصبی بهینه است (به فصل 5 مراجعه کنید). این طیف از پیکربندی‌های ممکن، روش گیره پچ را به یک تکنیک غیرمعمول و همه‌کاره برای مطالعات عملکرد کانال یونی تبدیل می‌کند. نسخه‌های رباتیک تکنیک گیره پچ راه خود را به صنعت باز کرده‌اند و به عنوان وسیله‌ای بسیار حساس و سریع برای غربالگری داروهای درمانی که بر کانال‌های یونی عمل می‌کنند، عمل می‌کنند.

Four configurations in patch clamp measurements of ion currents.

چهار پیکربندی در اندازه‌گیری جریان‌های یونی با گیره پچ.

The first direct evidence for the presence of voltage-sensitive, ion-selective channels in nerve cell membranes came from measurements of the ion currents flowing through individual ion channels. The voltage clamp apparatus used by Hodgkin and Huxley could only resolve the aggregate current resulting from the flow of ions through many thousands of channels. A technique capable of measuring the currents flowing through single channels was devised in 1976 by Erwin Neher and Bert Sakmann at the Max Planck Institute in Germany. This remarkable approach, called a patch clamp, revolutionized the study of membrane currents (Box 4A). In particular, the patch clamp method provided the means to test directly Hodgkin and Huxley’s deductions about the characteristics of ion channels.

اولین شواهد مستقیم برای وجود کانال‌های حساس به ولتاژ و یون‌گزین در غشاهای سلول‌های عصبی از اندازه‌گیری جریان‌های یونی که از طریق کانال‌های یونی منفرد جریان می‌یابند، به دست آمد. دستگاه گیره ولتاژ مورد استفاده توسط هاجکین و هاکسلی تنها می‌توانست جریان کل ناشی از جریان یون‌ها را از طریق هزاران کانال تفکیک کند. تکنیکی که قادر به اندازه‌گیری جریان‌های جریان یافته از طریق کانال‌های منفرد بود، در سال ۱۹۷۶ توسط اروین نهر و برت ساکمن در موسسه ماکس پلانک در آلمان ابداع شد. این رویکرد قابل توجه، که گیره وصله نامیده می‌شود، مطالعه جریان‌های غشایی را متحول کرد (کادر ۴A). به طور خاص، روش گیره وصله وسیله‌ای برای آزمایش مستقیم استنتاج‌های هاجکین و هاکسلی در مورد ویژگی‌های کانال‌های یونی فراهم کرد.

Currents flowing through Na⁺ channels are best examined in experimental circumstances that prevent the flow of current through other types of channels that are present in the membrane (e.g., K⁺ channels). Under such conditions, depolarizing a patch of membrane from a squid giant axon causes tiny inward currents to flow, but only occasionally (Figure 4.1). The size of these currents is minuscule—approximately l–2 pA (i.e., 10^–12 ampere)—but is stereotyped, reaching discrete values that suggest ion flux though individual, open ion channels. These currents are orders of magnitude smaller than the Na⁺ currents measured by voltage clamping the entire axon. The currents flowing through single channels are called microscopic currents to distinguish them from the macroscopic currents flowing through a large number of channels distributed over a much more extensive region of surface membrane. Although microscopic currents are certainly small, a current of 1 pA nonetheless reflects the flow of thousands of ions per millisecond. Thus, as predicted, a single channel can let many ions pass through the membrane in a very short time.

جریان‌هایی که از طریق کانال‌های ⁺Na عبور می‌کنند، بهتر است در شرایط آزمایشگاهی بررسی شوند که از عبور جریان از طریق انواع دیگر کانال‌های موجود در غشاء (مثلاً کانال‌های K⁺) جلوگیری می‌کنند. در چنین شرایطی، دپلاریزه کردن قسمتی از غشاء از یک آکسون غول‌پیکر ماهی مرکب باعث جریان یافتن جریان‌های کوچک به سمت داخل می‌شود، اما فقط گاهی اوقات (شکل ۴.۱). اندازه این جریان‌ها بسیار کوچک است – تقریباً ۱ تا ۲ پیکوآمپر (یعنی ۱۰ تا ۱۲ آمپر) – اما کلیشه‌ای است و به مقادیر گسسته‌ای می‌رسد که نشان دهنده شار یون از طریق کانال‌های یونی باز و منفرد است. این جریان‌ها چندین برابر کوچکتر از جریان‌های ⁺Na هستند که با اعمال ولتاژ به کل آکسون اندازه‌گیری می‌شوند. جریان‌هایی که از طریق کانال‌های منفرد عبور می‌کنند، جریان‌های میکروسکوپی نامیده می‌شوند تا از جریان‌های ماکروسکوپی که از طریق تعداد زیادی کانال توزیع شده در ناحیه بسیار وسیع‌تری از غشاء سطحی عبور می‌کنند، متمایز شوند. اگرچه جریان‌های میکروسکوپی قطعاً کوچک هستند، با این وجود جریان ۱ پیکوآمپر نشان دهنده جریان هزاران یون در هر میلی‌ثانیه است. بنابراین، همانطور که پیش‌بینی می‌شد، یک کانال واحد می‌تواند به یون‌های زیادی اجازه دهد تا در مدت زمان بسیار کوتاهی از غشا عبور کنند.

Several observations further proved that the microscopic currents in Figure 4.1B are due to the opening of single, voltage-activated Na⁺ channels. First, the currents are carried by Na⁺; thus, they are directed inward when the membrane potential is more negative than E _Na, reverse their polarity at E _Na, are outward at more positive potentials, and are reduced in size when the Na⁺ concentration of the external medium is decreased. This behavior exactly parallels that of the macroscopic Na⁺ currents described in Chapter 3 (see Figure 3.4). Second, the channels have a time course of opening, closing, and inactivating that matches the kinetics of macroscopic Na⁺ currents. This repeated depolarization of the membrane potential causes each Na⁺ channel to open and close many times. When the current responses to a large number of such stimuli are averaged together, the collective response has a time course that looks much like the macroscopic Na⁺ current (see Figure 4.1C). In particular, the channels open mostly at the beginning of a prolonged depolarization, showing that they activate and subsequently inactivate, as predicted from the macroscopic Na⁺ current (compare Figures 4.1C and D). Third, both the opening and closing of the channels are voltage-dependent; thus, the channels are closed at –80 mV but open when the membrane potential is depolarized. In fact, the probability that any given channel will be open varies with membrane potential (see Figure 4.1E), again as predicted from the macroscopic Na⁺ conductance (see Figure 3.7). Finally, tetrodotoxin, which blocks the macroscopic Na⁺ current (see Figure 3.5), also blocks microscopic Na⁺ currents. Taken together, these results show that the macroscopic Na⁺ current measured by Hodgkin and Huxley does indeed arise from the aggregate effect of many millions of microscopic Na⁺ currents, each representing the opening of a single voltage-sensitive Na⁺ channel.

مشاهدات متعدد دیگری ثابت کرد که جریان‌های میکروسکوپی در شکل 4.1B به دلیل باز شدن کانال‌های ⁺Na منفرد و فعال‌شده با ولتاژ هستند. اولاً، جریان‌ها توسط ⁺Na حمل می‌شوند؛ بنابراین، وقتی پتانسیل غشا منفی‌تر از ENa باشد، به سمت داخل هدایت می‌شوند، قطبیت خود را در ENa معکوس می‌کنند، در پتانسیل‌های مثبت‌تر به سمت خارج هستند و وقتی غلظت ⁺Na محیط خارجی کاهش می‌یابد، اندازه آنها کاهش می‌یابد. این رفتار دقیقاً مشابه جریان‌های ⁺Na ماکروسکوپی است که در فصل 3 شرح داده شده است (شکل 3.4 را ببینید). ثانیاً، کانال‌ها دارای یک سیر زمانی باز شدن، بسته شدن و غیرفعال شدن هستند که با سینتیک جریان‌های ⁺Na ماکروسکوپی مطابقت دارد. این دپلاریزاسیون مکرر پتانسیل غشا باعث می‌شود که هر کانال ⁺Na بارها باز و بسته شود. هنگامی که پاسخ‌های جریان به تعداد زیادی از چنین محرک‌هایی با هم میانگین‌گیری می‌شوند، پاسخ جمعی دارای یک سیر زمانی است که بسیار شبیه جریان ⁺Na ماکروسکوپی است (شکل 4.1C را ببینید). به طور خاص، کانال‌ها عمدتاً در ابتدای یک دپلاریزاسیون طولانی مدت باز می‌شوند، که نشان می‌دهد همانطور که از جریان ماکروسکوپی ⁺Na پیش‌بینی می‌شود، فعال و متعاقباً غیرفعال می‌شوند (شکل‌های 4.1C و D را مقایسه کنید). سوم، باز و بسته شدن کانال‌ها وابسته به ولتاژ هستند. بنابراین، کانال‌ها در 80- میلی‌ولت بسته می‌شوند اما وقتی پتانسیل غشا دپلاریزه می‌شود، باز می‌شوند. در واقع، احتمال اینکه هر کانال معین باز باشد با پتانسیل غشا متفاوت است (شکل 4.1E را ببینید)، همانطور که از رسانایی ماکروسکوپی ⁺Na پیش‌بینی می‌شود (شکل 3.7 را ببینید). در نهایت، تترودوتوکسین، که جریان ماکروسکوپی ⁺Na را مسدود می‌کند (شکل 3.5 را ببینید)، جریان‌های میکروسکوپی ⁺Na را نیز مسدود می‌کند. روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که جریان ماکروسکوپی ⁺Na اندازه‌گیری شده توسط هاجکین و هاکسلی در واقع از اثر تجمعی میلیون‌ها جریان میکروسکوپی ⁺Na ناشی می‌شود که هر کدام نشان‌دهنده باز شدن یک کانال ⁺Na حساس به ولتاژ هستند.

Membrane potential (mV)                     

FIGURE 4.1 Patch clamp measurements of ion currents flowing through single Na⁺ channels in a squid giant axon. In these experiments, Cs⁺ was applied to the axon to block voltage-gated K⁺ channels. Depolarizing voltage pulses (A) applied to a patch of membrane containing a single Na⁺ channel result in brief currents (B, downward deflections) in the seven successive recordings of membrane current (I _Na). The average of many such current records shows that most channels open in the initial 1–2 ms following depolarization of the membrane, after which the probability of channel openings diminishes because of channel inactivation. (D) A macroscopic current measured from another axon shows the close correlation between the time courses of microscopic and macroscopic Na⁺ currents. (E) The probability of a Na⁺ channel opening depends on the membrane potential, increasing as the membrane is depolarized. (B,C after Bezanilla and Correa, 1995; D after Vandenburg and Bezanilla, 1991; E after Correa and Bezanilla, 1994.)

شکل ۴.۱ اندازه‌گیری‌های گیره پچ جریان‌های یونی که از طریق کانال‌های ⁺Na منفرد در یک آکسون غول‌پیکر ماهی مرکب جریان می‌یابند. در این آزمایش‌ها، ⁺Cs به آکسون اعمال شد تا کانال‌های ⁺K وابسته به ولتاژ را مسدود کند. پالس‌های ولتاژ دپلاریزه کننده (A) که به یک تکه از غشاء حاوی یک کانال ⁺Na منفرد اعمال می‌شوند، منجر به جریان‌های کوتاهی (B، انحرافات رو به پایین) در هفت ثبت متوالی جریان غشاء (INa) می‌شوند. میانگین بسیاری از این ثبت‌های جریان نشان می‌دهد که اکثر کانال‌ها در 1-2 میلی‌ثانیه اولیه پس از دپلاریزاسیون غشاء باز می‌شوند، و پس از آن احتمال باز شدن کانال‌ها به دلیل غیرفعال شدن کانال کاهش می‌یابد. (D) یک جریان ماکروسکوپی اندازه‌گیری شده از آکسون دیگر، همبستگی نزدیک بین دوره‌های زمانی جریان‌های ⁺Na میکروسکوپی و ماکروسکوپی را نشان می‌دهد. (E) احتمال باز شدن کانال ⁺Na به پتانسیل غشاء بستگی دارد و با دپلاریزه شدن غشاء افزایش می‌یابد. (B، C به نقل از بزانیلا و کوریا، ۱۹۹۵؛ D به نقل از واندنبرگ و بزانیلا، ۱۹۹۱؛ E به نقل از کوریا و بزانیلا، ۱۹۹۴.)

Patch clamp experiments also revealed the properties of the channels responsible for the macroscopic K⁺ currents associated with action potentials. When the membrane potential is depolarized (Figure 4.2A), microscopic outward currents (Figure 4.2B) can be observed under conditions that block Na⁺ channels. The microscopic outward currents exhibit all the features expected for currents flowing through action potential-related K⁺ channels. Thus, the microscopic currents (Figure 4.2C), like their macroscopic counterparts (Figure 4.2D), fail to inactivate during brief depolarizations. Moreover, these single-channel currents are sensitive to ionic manipulations and drugs that affect the macroscopic K⁺ currents and, like the macroscopic K⁺ currents, are voltage-dependent (Figure 4.2E). This and other evidence shows that macroscopic K⁺ currents associated with action potential repolarization arise from the opening of many voltage-sensitive K⁺ channels.

آزمایش‌های گیره وصله‌ای همچنین خواص کانال‌های مسئول جریان‌های ماکروسکوپی ⁺K مرتبط با پتانسیل‌های عمل را آشکار کردند. هنگامی که پتانسیل غشا دپلاریزه می‌شود (شکل 4.2A)، جریان‌های میکروسکوپی رو به بیرون (شکل 4.2B) را می‌توان تحت شرایطی که کانال‌های ⁺Na را مسدود می‌کنند، مشاهده کرد. جریان‌های میکروسکوپی رو به بیرون، تمام ویژگی‌های مورد انتظار برای جریان‌هایی که از طریق کانال‌های ⁺K مرتبط با پتانسیل عمل جریان می‌یابند را نشان می‌دهند. بنابراین، جریان‌های میکروسکوپی (شکل 4.2C)، مانند همتایان ماکروسکوپی خود (شکل 4.2D)، در طول دپلاریزاسیون‌های کوتاه غیرفعال نمی‌شوند. علاوه بر این، این جریان‌های تک کاناله به دستکاری‌های یونی و داروهایی که بر جریان‌های ⁺K ماکروسکوپی تأثیر می‌گذارند، حساس هستند و مانند جریان‌های ⁺K ماکروسکوپی، وابسته به ولتاژ هستند (شکل 4.2E). این و سایر شواهد نشان می‌دهد که جریان‌های ⁺K ماکروسکوپی مرتبط با رپلاریزاسیون پتانسیل عمل از باز شدن بسیاری از کانال‌های ⁺K حساس به ولتاژ ناشی می‌شوند.

FIGURE 4.2 Patch clamp measurements of ion currents flowing through single K⁺ channels in a squid giant axon. In these experiments, tetrodotoxin was applied to the axon to block voltage-gated Na+ channels. Depolarizing voltage pulses (A) applied to a patch of membrane containing a single K⁺ channel result in brief currents (B, upward deflections) whenever the channel opens. (C) The average of such current records shows that most channels open with a delay, but remain open for the duration of the depolarization. (D) A macroscopic current measured from another axon shows the correlation between the time courses of microscopic and macroscopic K⁺ currents. (E) Membrane potential controls K⁺ channel opening, with the probability of a channel opening increasing as the membrane is depolarized. (B,C after Augustine and Bezanilla, in Hille 2001; D after Augustine and Bezanilla, 1990; E after Perozo et al., 1991.)

شکل ۴.۲ اندازه‌گیری‌های جریان‌های یونی که از طریق کانال‌های ⁺K منفرد در یک آکسون غول‌پیکر ماهی مرکب جریان می‌یابند با استفاده از گیره وصله. در این آزمایش‌ها، تترودوتوکسین به آکسون اعمال شد تا کانال‌های ⁺Na وابسته به ولتاژ را مسدود کند. پالس‌های ولتاژ دپلاریزه کننده (A) که به یک تکه از غشاء حاوی یک کانال ⁺K منفرد اعمال می‌شوند، هر زمان که کانال باز می‌شود، جریان‌های کوتاهی (B، انحراف به سمت بالا) ایجاد می‌کنند. (C) میانگین چنین رکوردهای جریانی نشان می‌دهد که اکثر کانال‌ها با تأخیر باز می‌شوند، اما برای مدت زمان دپلاریزاسیون باز می‌مانند. (D) یک جریان ماکروسکوپی اندازه‌گیری شده از آکسون دیگر، همبستگی بین دوره‌های زمانی جریان‌های ⁺K میکروسکوپی و ماکروسکوپی را نشان می‌دهد. (E) پتانسیل غشاء، باز شدن کانال ⁺K را کنترل می‌کند، و احتمال باز شدن کانال با دپلاریزه شدن غشاء افزایش می‌یابد. (B،C پس از آگوستین و بزانیلا، در هیل ۲۰۰۱؛ D پس از آگوستین و بزانیلا، ۱۹۹۰؛ E پس از پروزو و همکاران، ۱۹۹۱.)

In summary, patch clamping has allowed direct observation of microscopic currents flowing through single ion channels, confirming that voltage-sensitive Na⁺ and K⁺ channels are responsible for the macroscopic conductances and currents that underlie the action potential. Measurements of the behavior of single ion channels have also provided insight into the molecular attributes of these channels For example, such single channel studies show that the squid axon membrane contains at least two types of channels—one selectively permeable to Na⁺ and a second selectively permeable to K⁺. This ion selectivity means that these channels are able to discriminate between Na⁺ and K⁺. Because their opening is influenced by membrane potential, both channel types are voltage gated. For each channel, depolarization increases the probability of channel opening, whereas hyperpolarization closes them (see Figures 4.1E and 4.2E). Thus, both channel types must have a voltage sensor that detects the potential across the membrane (Figure 4.3). However, these channels differ in important respects. In addition to differences in ion selectivity, the kinetic properties of the gating of the two channels differ as expected from the macroscopic behavior of the Na⁺ and K⁺ currents described in Chapter 3. Further, depolarization inactivates the Na⁺ channel but not the K⁺ channel, causing Na⁺ channels to pass into a nonconducting state. The Na⁺ channel must therefore have an additional molecular mechanism responsible for inactivation. Finally, these channel proteins provide unique binding sites for drugs and for various neurotoxins known to block specific subclasses of ion channels (Box 4B). This information about the physiology of ion channels set the stage for subsequent studies of their workings at the molecular level.

به طور خلاصه، بستن پچ امکان مشاهده مستقیم جریان‌های میکروسکوپی جاری از طریق کانال‌های یونی منفرد را فراهم کرده است و تأیید می‌کند که کانال‌های ⁺Na و ⁺K حساس به ولتاژ مسئول رسانایی‌ها و جریان‌های ماکروسکوپی هستند که زیربنای پتانسیل عمل هستند. اندازه‌گیری رفتار کانال‌های یونی منفرد همچنین بینشی در مورد ویژگی‌های مولکولی این کانال‌ها ارائه داده است. به عنوان مثال، چنین مطالعات تک کانالی نشان می‌دهد که غشای آکسون ماهی مرکب حداقل شامل دو نوع کانال است – یکی به طور انتخابی نسبت به ⁺Na نفوذپذیر است و دیگری به طور انتخابی نسبت به ⁺K نفوذپذیر است. این گزینش‌پذیری یونی به این معنی است که این کانال‌ها قادر به تمایز بین ⁺Na و ⁺K هستند. از آنجا که باز شدن آنها تحت تأثیر پتانسیل غشا قرار می‌گیرد، هر دو نوع کانال دارای دریچه ولتاژ هستند. برای هر کانال، دپلاریزاسیون احتمال باز شدن کانال را افزایش می‌دهد، در حالی که هایپرپلاریزاسیون آنها را می‌بندد (به شکل‌های 4.1E و 4.2E مراجعه کنید). بنابراین، هر دو نوع کانال باید یک حسگر ولتاژ داشته باشند که پتانسیل را در سراسر غشاء تشخیص دهد (شکل 4.3). با این حال، این کانال‌ها از جنبه‌های مهمی با هم تفاوت دارند. علاوه بر تفاوت در گزینش‌پذیری یونی، خواص جنبشی دریچه‌های دو کانال، همانطور که از رفتار ماکروسکوپی جریان‌های ⁺Na و ⁺K که در فصل 3 توضیح داده شده است، انتظار می‌رود، متفاوت است. علاوه بر این، دپلاریزاسیون کانال ⁺Na را غیرفعال می‌کند اما کانال ⁺K را نه، و باعث می‌شود کانال‌های ⁺Na به حالت غیر رسانا منتقل شوند. بنابراین، کانال ⁺Na باید یک مکانیسم مولکولی اضافی داشته باشد که مسئول غیرفعال‌سازی است. در نهایت، این پروتئین‌های کانال، مکان‌های اتصال منحصر به فردی را برای داروها و برای نوروتوکسین‌های مختلف که به عنوان مسدودکننده زیرگروه‌های خاصی از کانال‌های یونی شناخته می‌شوند، فراهم می‌کنند (کادر 4B). این اطلاعات در مورد فیزیولوژی کانال‌های یونی، زمینه را برای مطالعات بعدی در مورد عملکرد آنها در سطح مولکولی فراهم می‌کند.

FIGURE 4.3 Functional states of voltagegated Na⁺ and K⁺ channels. The gates of both channels are closed when the membrane potential is hyperpolarized. When the potential is depolarized, voltage sensors (indicated by +) allow the channel gates to open—first the Na⁺ channels and then the K⁺ channels. Na⁺ channels also inactivate during prolonged depolarization, whereas many types of K⁺ channels do not.

شکل ۴.۳ حالت‌های عملکردی کانال‌های ⁺Na و ⁺K دارای دریچه ولتاژ. دریچه‌های هر دو کانال هنگامی که پتانسیل غشا بیش از حد قطبی می‌شود، بسته می‌شوند. هنگامی که پتانسیل دپلاریزه می‌شود، حسگرهای ولتاژ (که با + نشان داده شده‌اند) به دریچه‌های کانال اجازه می‌دهند باز شوند – ابتدا کانال‌های ⁺Na و سپس کانال‌های ⁺K. کانال‌های ⁺Na نیز در طول دپلاریزاسیون طولانی غیرفعال می‌شوند، در حالی که بسیاری از انواع کانال‌های ⁺K غیرفعال نمی‌شوند.

How Ion Channels Work