علوم اعصاب پروس؛ تصویربرداری پویا از سیگنالینگ درون سلولی

BOX  7A   Dynamic Imaging of Intracellular Signaling

Dramatic breakthroughs in our understanding of the brain often rely on development of new experi mental techniques. This certainly has been true for our understanding of intracellular signaling in neurons, which has benefited enormously from the invention of imaging techniques that allow direct visualization of signaling processes with- in living cells. The first advance—and arguably the most significant—came from the development, by Roger Tsien and his colleagues, of the fluorescent dye fura-2 (Figure A). Calcium ions bind to fura-2 and cause the dye’s fluorescence properties to change. When fura- 2 is introduced inside cells and the cells are then imaged with a fluorescence mi- croscope, this dye serves as a reporter of intracellular Ca²⁺ concentration. Fura-2 imaging has allowed investigators to detect the spatial and temporal dynamics of the Ca²⁺ signals that trigger innumerable process within neurons and glial cells; for example, fura-2 was used to obtain the image of Ca²⁺ signaling during neurotransmitter release shown in Figure 5.10A.

کادر ۷A  تصویربرداری پویا از سیگنالینگ درون سلولی

پیشرفت‌های چشمگیر در درک ما از مغز اغلب به توسعه تکنیک‌های تجربی جدید متکی است. این امر مطمئناً در مورد درک ما از سیگنالینگ درون سلولی در نورون‌ها نیز صادق بوده است، که از اختراع تکنیک‌های تصویربرداری که امکان تجسم مستقیم فرآیندهای سیگنالینگ را در سلول‌های زنده فراهم می‌کنند، بسیار سود برده است. اولین پیشرفت – و مسلماً مهم‌ترین آنها – از توسعه رنگ فلورسنت fura-2 توسط راجر تسین و همکارانش حاصل شد (شکل A). یون‌های کلسیم به fura-2 متصل می‌شوند و باعث تغییر خواص فلورسانس رنگ می‌شوند. هنگامی که fura-2 به داخل سلول‌ها وارد می‌شود و سپس سلول‌ها با میکروسکوپ فلورسانس تصویربرداری می‌شوند، این رنگ به عنوان گزارشگر غلظت ⁺Ca² درون سلولی عمل می‌کند. تصویربرداری Fura-2 به محققان این امکان را داده است تا دینامیک مکانی و زمانی سیگنال‌های ⁺Ca² را که فرآیندهای بی‌شماری را در نورون‌ها و سلول‌های گلیال آغاز می‌کنند، تشخیص دهند. برای مثال، از fura-2 برای به دست آوردن تصویر سیگنالینگ ⁺Ca² در طول آزادسازی انتقال‌دهنده عصبی که در شکل 5.10A نشان داده شده است، استفاده شد.

Subsequent refinement of the chemical structure of fura-2 has yielded many other fluorescent Ca²⁺ indicator dyes with different fluorescence properties and different sensitivities to Ca²⁺. One of these dyes is Calcium Green, which was used to image the dynamic changes in Ca²⁺ concentration produced within the dendrites of cerebellar Purkinje cells by the intracellular messenger IP₃ (Figure B). Further developments have led to indicators for visualizing the spatial and temporal dynamics of other second-messenger signals, such as cAMP.

اصلاح بعدی ساختار شیمیایی fura-2 منجر به تولید بسیاری از رنگ‌های نشانگر ⁺Ca² فلورسنت دیگر با خواص فلورسانس متفاوت و حساسیت‌های متفاوت به ⁺Ca² شده است. یکی از این رنگ‌ها، کلسیم گرین است که برای تصویربرداری از تغییرات دینامیکی غلظت ⁺Ca² تولید شده در دندریت‌های سلول‌های پورکنژ مخچه توسط پیام‌رسان درون سلولی IP₃ (شکل B) استفاده شد. پیشرفت‌های بیشتر منجر به ایجاد شاخص‌هایی برای تجسم دینامیک مکانی و زمانی سایر سیگنال‌های پیام‌رسان ثانویه، مانند cAMP، شده است.

Another tremendous advance in the dynamic imaging of signaling process- es came from the discovery of a green fluorescent protein that was first isolated from the jellyfish Aequorea victoria by Osamu Shimomura. Green fluorescent protein, or GFP, is (as its name indicates) a protein that is brightly fluorescent (Figure C). Molecular cloning of the GFP gene allows imaging techniques to visualize expression of gene products labeled with GFP fluorescence. The first such use of GFP was in experiments with the  worm  Caenorhabditis  elegans,  in which Martin Chalfie and his colleagues rendered neurons fluorescent by inducing GFP expression in these cells. Many subsequent experiments have used ex- pression of GFP to image the structure of individual neurons in the mammalian brain (Figure D).

پیشرفت عظیم دیگری در تصویربرداری پویا از فرآیندهای سیگنالینگ، از کشف یک پروتئین فلورسنت سبز حاصل شد که اولین بار توسط اوسامو شیمومورا از عروس دریایی Aequorea victoria جدا شد. پروتئین فلورسنت سبز یا GFP (همانطور که از نامش پیداست) پروتئینی است که به شدت فلورسنت است (شکل C). کلونینگ مولکولی ژن GFP به تکنیک‌های تصویربرداری اجازه می‌دهد تا بیان محصولات ژنی برچسب‌گذاری شده با فلورسانس GFP را تجسم کنند. اولین استفاده از GFP در آزمایش‌هایی با کرم Caenorhabditis elegans بود که در آن مارتین چالفی و همکارانش با القای بیان GFP در این سلول‌ها، نورون‌ها را فلورسنت کردند. بسیاری از آزمایش‌های بعدی از بیان GFP برای تصویربرداری از ساختار نورون‌های منفرد در مغز پستانداران استفاده کرده‌اند (شکل D).

Molecular genetic strategies make it possible to attach GFP to almost any protein, thereby allowing fluorescence microscopy to image the spatial distribution of labeled proteins. In this way, it has been possible to visualize dynamic changes in the location of neuronal proteins during signaling events. Related techniques also allow visualization of the location of second-messenger signals or the biochemical activity of signaling proteins. For example, Figure 8.12 illustrates the use of this approach to monitor the activation of CaMKII during long-term synaptic potentiation.

استراتژی‌های ژنتیک مولکولی امکان اتصال GFP را به تقریباً هر پروتئینی فراهم می‌کنند و در نتیجه به میکروسکوپ فلورسانس اجازه می‌دهند تا توزیع فضایی پروتئین‌های برچسب‌گذاری شده را تصویربرداری کند. به این ترتیب، تجسم تغییرات پویا در محل پروتئین‌های عصبی در طول رویدادهای سیگنالینگ امکان‌پذیر شده است. تکنیک‌های مرتبط همچنین امکان تجسم محل سیگنال‌های پیام‌رسان ثانویه یا فعالیت بیوشیمیایی پروتئین‌های سیگنالینگ را فراهم می‌کنند. به عنوان مثال، شکل 8.12 استفاده از این رویکرد را برای نظارت بر فعال شدن CaMKII در طول تقویت سیناپسی طولانی مدت نشان می‌دهد.

As was the case with fura-2, subsequent refinement of GFP has led to numerous improvements. One significant improvement, also pioneered by Roger Tsien, was the production of proteins that fluoresce in colors other than green, thus permitting the simultaneous imaging of multiple types of proteins and/or neurons. A particularly vivid demonstration of the power of multicolor imaging of fluorescent proteins can be seen in Brainbow, a technique that uses differential expression of combinations of several fluorescent proteins to label neurons with one of nearly 100 different colors (Figure E). This permits the axons of individual neurons to be identified and fol- lowed, even through the complex tangle of neuronal processes typically found in the CNS, thereby defining the circuits formed by the labeled neurons.

همانند fura-2، اصلاح بعدی GFP منجر به پیشرفت‌های متعددی شده است. یکی از پیشرفت‌های قابل توجه، که توسط راجر تسین نیز پیشگام بود، تولید پروتئین‌هایی بود که در رنگ‌هایی غیر از سبز فلورسنت می‌شوند و بنابراین امکان تصویربرداری همزمان از انواع مختلف پروتئین‌ها و/یا نورون‌ها را فراهم می‌کنند. نمایش واضحی از قدرت تصویربرداری چندرنگ از پروتئین‌های فلورسنت را می‌توان در Brainbow مشاهده کرد، تکنیکی که از بیان افتراقی ترکیبات چندین پروتئین فلورسنت برای برچسب‌گذاری نورون‌ها با یکی از تقریباً 100 رنگ مختلف استفاده می‌کند (شکل E). این امر امکان شناسایی و دنبال کردن آکسون‌های نورون‌های منفرد را فراهم می‌کند، حتی از طریق درهم‌تنیدگی پیچیده فرآیندهای عصبی که معمولاً در CNS یافت می‌شوند، و در نتیجه مدارهای تشکیل شده توسط نورون‌های برچسب‌گذاری شده را تعریف می‌کند.

Just as development of the Golgi staining technique opened our eyes to the cellular composition of the brain see Chapter 1), study of intracellular signaling in the brain has been revolutionized by fura-2, GFP, and other fluorescent tools. There is no end in sight for the potential of such imaging methods to illuminate new and important aspects of brain signaling dynamics.

همانطور که توسعه تکنیک رنگ‌آمیزی گلژی چشمان ما را به ترکیب سلولی مغز باز کرد (به فصل 1 مراجعه کنید)، مطالعه سیگنالینگ درون سلولی در مغز توسط fura-2، GFP و سایر ابزارهای فلورسنت متحول شده است. هیچ پایانی برای پتانسیل چنین روش‌های تصویربرداری برای روشن کردن جنبه‌های جدید و مهم دینامیک سیگنالینگ مغز وجود ندارد.

(الف) ساختار شیمیایی رنگ نشانگر Ca²⁺ fura-2. (ب) تصویربرداری از تغییرات غلظت ⁺Ca² درون سلولی (رنگ) تولید شده در یک نورون پورکنژ مخچه‌ای توسط عملکرد پیام‌رسان ثانویه IP₃. (ج) ساختار مولکولی پروتئین فلورسنت سبز. GFP به شکل یک قوطی است که بخش فلورسنت آن درون قوطی قرار دارد. (د) بیان GFP ساختار یک نورون هرمی در قشر مغز را نشان می‌دهد. (ه) نورون‌های هیپوکامپ که با ترکیبات مختلفی از پروتئین‌های فلورسنت متعدد برچسب‌گذاری شده‌اند و یک «کمان مغزی» از رنگ‌ها را ایجاد می‌کنند. (الف) برگرفته از گرینکیویچ و همکاران، ۱۹۸۵؛ ب) برگرفته از فینچ و آگوستین، ۱۹۹۸؛ ج) برگرفته از جی.جی. آگوستین؛ د) برگرفته از ویدال و همکاران، ۲۰۱۶؛ ه) برگرفته از لیوت و همکاران، ۲۰۰۷.)