رونویسی در پروکاریوت‌ و یوکاریوت؛ پروتئین‌های تنظیمی؛ پیرایش

مکانیسم رونویسی

ژن‌ها توالی‌های کشیده شده ای از DNA است که اطلاعات ژنتیکی را در خود نگه داری می‌کند که بوسیله کدهای ژنتیکی زخیره شده اند. هر ملکول DNA شامل دو رشته است که هر کدام دو سر ۳’،۵’ دارند. مناطق کدینگ شامل اطلاعات ژنتیکی هستند و قسمت‌هایی که اطلاعات ژنتیکی ندارند در تولید RNAها کمک می‌کنند. تولید یک کپی RNA از روی DNA را مرحله رونویسی گویند، این فرایند به وسیله‌ی RNA polymerase انجام می‌شود که در هر لحظه یکه نوکلئوتید RNA را به رشته‌ی RNA درحال تولید، اضافه می‌کند. رشته ی RNA بارشته‌ی DNA اصلی یکسان است تنها با این تفاوت که در آن به جای تیامین (T) از یوراسیل (U) استفاده شده است عمل رونویسی در پروکاریوت‌ها بوسیله یک پلیمراز انجام می‌شود اما در یوکاریوت‌ها این عمل بوسیله سه پلیمراز مختلف صورت می‌گیرد که پلیمراز اول برای رونویسی rRNAها است و پلیمراز دوم برای رونویسی mRNA، snRNA و.. استفاده می‌شود و پلیمراز سوم در ترجمه tRNA، rRNA کاربرد دارد. عمل رونویسی پس از رسیدن به یک توالی مشخص خاتمه می یابد.

به رشته DNA که به عنوان الگو برای سنتز RNA قرار می گیرد، رشته آنتی سنس (رشته غیر کدکننده) و به رشته مقابل آن در مولکول DNA، رشته سنس (رشته کدکننده) گفته می شود.

رونویسی در پروکاریوت ها:

آنزیم RNA پلیمراز E.coli 

 یک نوع متالوآنزیم حاوی دو یون +Zn2 و دارای یک هسته پلیمرازی a2BBw است که قابلیت سنتز RNA را دارد ولی تمایل آن برای توالی های مختلف DNA یکسان است. با اضافه شدن زیر واحد سیگما ساختمان هولوآنزیم تکمیل می شود. زیر واحد سیگما در شناسایی توالی پروموتر نقش داشته و بعد از شروع رونویسی از هسته آنزیم جدا می‌شود. زیر واحدهای آلفا در تعامل با پروتئین‌های تنظیمی و توالی های تنظیمی فرادست نقش دارند. زیر واحد بتا مسئول ایجاد پیوند فسفودی استری می‌باشد زیر واحد بتا پریم به رشته الگوی DNA متصل می‌شود. نقش زیر واحد w شناخته شده نیست.

فاکتورهای سیگمای اختصاصی می توانند کلاس‌های مختلف ژن‌ها را تشخیص دهند. این زیر واحدها بر اساس وزن مولکولی خود مشخص می‌شوند. دو نمونه معمول شامل سیگما ۷۰ و سیگما ۳۲ می باشند که به ترتیب در رونویسی ژن های معمولی و ژن های شوک حرارتی نقش دارند.

شروع رونویسی

رونویسی پروکاریوتی با اتصال RNA پلیمراز به پروموتر یک ژن آغاز می‌گردد. هولوآنزیم RNA پلیمراز به یک سمت از DNA اتصال یافته در حدود ۴۵ جفت باز فرادست و ۱۰ جفت باز فرودست ناحیه شروع رونویسی گسترش می یابد. دو توالی کوتاه در این ناحیه بسیار محافظت شده اند. یکی از این توالی های حفاظت شده حدود ۱۰ جفت باز در فرادست ناحیه شروع رونویسی با توالی مشترک TATAAT قرار دارد که جعبه پریبنو یا ۱۰- (جعبه TATA) نامیده می‌شود. دومین توالی محافظت شده، توالی مشترک TTGACA است که در حدود ۳۵ جفت باز در فرادست ناحیه شروع رونویسی قرار دارد و توالی ۳۵- نامیده می شود. فاصله این دو توالی دارای ۱۷ جفت باز است که به شدت محافظت شده اند.

پایان رونویسی

کمپلکس RNA پلیمراز انتهای ژن ها را نیز شناسایی می کند. خاتمه رونویسی می تواند در دو حالت وابسته به فاکتور پروتئینی p (rho) یا غیر وابسته به آن انجام گردد. خاتمه دهنده ها نیز به دو صورت وابسته به p یا غیر وابسته به آن طبقه بندی می شوند. پروتئین NusA ممکن است در هر دو مکانیسم نقش داشته باشند. در خاتمه رونویسی وابسته به p، یک توالی حفاظت شده پالیندرومی (تکرار معکوس) غنی از CG وجود دارد که ایجاد ساختار ساقه-حلقه (سنجاق سر) پایدار در رشته RNA می کند. بعد از این ساختار، یک توالی U در رشته RNA وجود دارد که مکمل توالی A در رشته الگو است. جفت AU ضعیف بوده و هیبرید RNA-DNA را از بین می برد تا RNA آزاد گردد. در خاتمه رونویسی غیر وابسته به p، توالی های غنی از C وجود دارند که در فاصله کمی از فرادست جایگاه خاتمه قرار دارند. فاکتور rho، پروتئین هگزامری است که فعالیت ATPase وابسته به RNA دارد. فاکتور p با عمل وابسته به ATP در طول زنجیره RNA تازه ساخته شده جابجا می شود تا بدین وسیله فاکتور p به RNA پلی‌مراز برسد. در این زمان rho کمپلکس طویل سازی را ناپایدار می کند. این امر منجر به جداسازی DNA الگو و زنجیره RNA کامل از یکدیگر و از پلی‌مراز می شود.

رونویسی در یوکاریوت ها

شروع رونویسی

RNA پلیمراز II، کلاس‌های متعددی از توالی‌های محافظت شده بالادست را که مربوط به ناحیه شروع mRNA هستند، شناسایی می‌کند. نخستین و مهم‌ترین این توالی‌ها جعبه TATA است که دارای توالی TATA (A/T)(A/T) A می باشد که حدود ۲۵ جفت باز در فرادست نقطه شروع رونویسی قرار دارد. سایر عناصر کنترل کننده نزدیک (فرادست) پروموتر در ژن هایی که به وسیله RNAپلی‌مراز ۲ رونویسی می شوند شامل جعبه CAAT که در موقعیت ۶۰- تا ۸۰- جفت باز در ناحیه فرادست نقطه آغاز رونویسی و جعبه GC که قبل از TATA قرار دارند، می‌باشند. (جعبه CAAT یک جایگاه اتصال برای عوامل رونویسی مختلفی از جمله NF1 است و جعبه GC یک جایگاه اتصالی برای فاکتور رونویسی SP1 است).

برخی توالی های تنظیمی می توانند هزاران جفت باز دورتر از جایگاه تجمع کمپلکس پیش آغازین و همچنین در بالا دست یا پایین دست نقطه شروع رونویسی واقع شوند.

TF2D کمپلکسی چند زیر واحدی است که دارای TBP (پروتئین متصل شونده بهTATA) و چندین TAF (فاکتورهای مرتبط باTBP) متفاوت است. TF2D به شیار کوچک DNA در توالی قراردادی TATA متصل می‌شود که حدود ۲۷ جفت باز در بالا دست جایگاه شروع رونویسی قرار گرفته است. تشکیل کمپلکس پیش آغازین اجازه فعالیت هلیکازی وابسته به ATP را به TF2H می دهد تا دو رشته DNA باز گردد و یک الگو برای ساخت RNA در مرحله طویل سازی فراهم شود. TF2H در حالی که هنوز به جعبه TATA متصل است در عقب می ماند تا از این طریق تجمع کمپلکس های پیش آغازین بیشتری را افزایش دهد.

در طول فاز طویل سازی TF2F با RNA پلیمراز ۲ حرکت می کند اما سایر فاکتورهای رونویسی عمومی از کمپلکس طویل سازی جدا می شود. زیر واحد بزرگ RNA پلیمراز ۲ دارای یک دومن C-ترمینال (CTD) است که برای جفت کردن رونویسی و پردازش عمل می کند. هنگامی که RNA پلیمراز ۲ در فاز شروع رونویسی است، CTD تغییر نمی کند. هنگامی که رونوشت حدود ۲۵ نوکلئوتید شد، CTD به طور وسیعی فسفریله می شود. CTD فسفریله شده به طور متوالی آنزیم های مسئول کلاهک سازی پردازش و کمپلکس های پلی آدنیلاسیون را به کار می گیرند.

پروتئین های تنظیمی یوکاریوتی

به عوامل پروتئینی که بهDNA متصل شده و رونویسی را تنظیم می کنند عناصر با فعالیت ترانس گویند. این عوامل دارای موتیف های زیر می باشند:

موتیف مارپیچ-حلقه-مارپیچ (HLH)

شامل حدود ۵۰ اسید آمینه در دو مارپیچ آلفا می باشد که توسط یک قوس به یکدیگر اتصال می یابند. موتیف HLH در فاکتورهای رونویسی myoD، myc، max مشاهده می گردد.

موتیف مارپیچ-دور-مارپیچ (HTH)

شامل حدود ۱۲۰ اسید آمینه در دو قطعه مارپیچ آلفا کوتاه (هر کدام با ۷ تا ۹) اسید آمینه که توسط یک پیچ بتا به یکدیگر متصل می گردند. این موتیف در پروتئین های تنظیمی پروکاریوتی (معمول ترین واحد اتصال بهDNA در پروکاریوت ها)، تعداد کمی از پروتئین های یوکاریوتی و پروتئین تنظیم کننده Cro فاژ لامبدا وجود دارد. ساختمان هومئودومن مشابه موتیف HTH در پروکاریوت ها است و همانند آن ها به شکل دیمر اتصال می یابد.

موتیف انگشت روی (Zinc finger)

 شامل ۳۰ اسید آمینه به صورت دیمر است که هر منومر آن از یک مارپیچ آلفا تشکیل شده است که در اثر تعامل کئوردینانس یونZn++ با اسیدهای آمینه اختصاصی پایدار می گردد. بر اساس نوع اسید آمینه چند کلاس پروتئین انگشت روی وجود دارد: در تعامل با چهار ریشه Cys (کلاس C4) مثل خانواده گیرنده های مربوط به هورمون های استروئیدی در تعامل با دو ریشه Cys و دو ریشه His(کلاسC2H2 ) مثل انواع موجود در TF3A

زیپ لوسینی بازی (bZip)

به شکل مارپیچ آلفا است که در موقعیت هفتم آن لوسین قرار دارد. وجود این ساختمان در دو منومر سبب زیپ شدن آن ها و ایجاد دیمر می شود (مثل Jun-Jun یا Fos-Jun ) قسمت ابتدایی مارپیچ های مربوط به زیپ های لوسینی دارای اسیدهای آمینه بازی آرژنین و لیزین هستند. از این رو به آن ها زیپ لوسینی بازی (bZip) اطلاق می شود. bZip از طریق قرارگیری در شیار بزرگ با DNA تعامل دارند. پروتئین های بازی زیپ لوسین شامل Jun، Fos،CREB می باشند.

پردازش RNAهای پیک

پردازش mRNA شامل ایجاد کلاهک در انتهای ۵، پیرایش، برش همراه با ایجاد دم پلی A در انتهای ۳ می باشد. تمامی این فرایندها در هسته انجام می شوند. ایجاد کلاهک بلافاصله بعد از شروع رونویسی و حتی قبل از تکمیل تولید رونوشت های اولیه hnRNA صورت می پذیرد. پیرایش نیز همزمان با رونویسی و ایجاد دم پلی A در پایان رونویسی صورت می گیرد.

ایجاد کلاهک

مستلزم افزودن یک نوکلئوتید گوانینی با اتصال غیر معمول ۵-۵ تری فسفات به نوکلئوتید پورینی انتهایی توسط گوانیل ترانسفراز می باشد. با افزودن یک ریشه متیل به موقعیت ۷ این گوانین تولید کلاهک صفر می شود که در مخمرها شایع می باشد. در مهره داران یک ریشه متیل دیگر به موقعیت ۲-هیدروکسیل پورین انتهایی اضافه شده و تولید کلاهک ۱ می گردد. دهنده ریشه متیل در این واکنش s-آدنوزیل متیونین است.

ایجاد دم پلی A

در طی دو مرحله شکست و پلی آدنیلاسیون انجام می شود. مرحله شکست مستلزم تجزیه یک پیوند ۳-۵ فسفودی استری توسط یک اندونوکلئاز اختصاصی در یک موقعیت مشخص انتهای ۳ مولکول پیش ساز mRNA (معمولا ۱۰ تا ۲۰جفت باز در فرودست جایگاه اختصاصی AAUAAA) می باشد. سپس پلی آدنیلات پلیمراز بدون الگو و با استفاده ازATP دم پلی Aبا طول حدود ۲۰۰ تا ۲۵۰ نوکلئوتید را سنتز می کند. تمامی مولکول های mRNA حاوی دم پلی A نیستند. مولکول هایmRNA هیستونی فاقد دم پلی A می باشند.

پیرایش

اینترون های پیرایشی عموما در دو انتهای دارای توالی دی نوکلئوتیدیGU در سمت ۵ وAG در سمت ۳ می باشد که محل پیرایش را مشخص می کنند. علاوه بر این توالی ها یک نوکلئوتیدی آدنینی به عنوان جایگاه شاخه در نزدیکی انتهای ۳ اینترون برای پیرایش مورد نیاز است. مراحل پیرایش عبارتند از: snRNP U1 به جایگاه ۵ تازه سنتز اتصال می یابد. اتصالsnRNP U2 به جایگاه شاخه اینترون و تولید کمپلکس پایداری که حدود ۴۰ نوکلئوتید را می پوشاند snRNP U5 به جایگاه ۳ متصل می گردد. کمپلکس snRNP U4/U6 اضافه شده تا با کشاندن تمامی اسنورپ ها به سمت یکدیگر همایش اسپلایسئوزوم را تکمیل کند U4 ازU6 جدا شده تا امکان تعامل U6 با U2 و سپسU1 فراهم گردد. فرایند پیرایش شامل شکستن دو پیوند فسفودی استری متصل کننده دو انتهای اینترون به اگزون های ۵ و ۳ و سپس اتصال مجدد دو اگزون با ایجاد یک پیوند فسفودی استری می باشد. مارپیچU2-U6 احتمالا جایگاه کاتالیتیک اسپلایسئوزوم را تشکیل می دهد. U4 به عنوان یک مهار کنندهU6 عمل نموده و تا زمان قرارگیری در کنار جایگاه های اختصاصی پیرایش U6 را می پوشاند.

پردازشRNA های ناقل

tRNA ها حدود ۱۱۰-۶۵ نوکلئوتید طول دارند. بخش های دو رشته ایtRNA دارای ساختمان فضایی شبیه به مولکول A-DNA می باشد. هر مولکول tRNA معمولا چهار بازو یا ساقه دارد:

بازوی گیرنده یا اسید آمینه: حاوی هر دو انتهای ۵ و ۳ مولکول بوده و برخلاف سایر بازوها در انتهای آن قوس وجود ندارد. در انتهای ۵ یک نوکلئوتید فسفریله (اکثرا pG) و در انتهای ۳ توالی ۳-CCA وجود دارد. اسید آمینه با یک پیوند استری بین گروه آلفا-کربوکسیل خود و گروه ۳- یدروکسیل آدنیلات انتهایی بهtRNA اتصال می یابد؛ این اتصال ممکن است به ۲-هیدروکسیل آدنیلات نیز صورت بگیرد، ولی در هنگام شرکت در سنتز پروتئین، حتما متصل به گروه ۳-هیدروکسیل می باشد. بازوی آنتی کدون در مقابل بازوی اسید آمینه قرار دارد که قوس انتهای آن حاوی توالی سه نوکلئوتیدی مکمل توالی سه نوکلئوتیدی کدون مربوطه است. بازویD در سمت ۵ بوده و حاوی دو یا چند دی هیدرویوریدین است. بازوی D در شناسایی آمینواسیل- tRNA سنتتاز نقش دارد بازوی پسودویوریدین در سمت ۳ بوده و حاوی توالی ریبوتیمیدین، پسودویوریدین، سیتیدین می باشد. این بازو با rRNA زیر واحد بزرگ ریبوزوم تعامل می نماید.

در مولکول tRNA، در بین ساقه های اسید آمینه و آنتی کدون، بازوی دیگری به نام بازوی اضافی یا متغیر وجود دارد که طول آن در مولکول های مختلف از ۳ تا ۲۱ نوکلئوتید متفاوت است.

توالی های همه مولکول های tRNA می توانند از طریق جفت شدن واتسون-کریکی و ایجاد ساختارهای ساقه و حلقه به صورت ساختار دوم برگ شبدری درآیند. همچنین پیوندهای هیدروژنی غیر واتسون-کریکی اضافی منجر به تشکیل ساختار سوم L مانند در مولکول tRNA می شود. جفت باز غیر واتسون-کریکی در ساختار tRNA معمولا از نوع UG می باشد.

ابتدا اندونوکلئازRNase P به عنوان یک ریبوزیم با جداسازی یک قطعه از انتهای ۵ پیش ساز انتهای ۵ بالغ را به وجود می آورد سپس اگزونوکلئاز RNase D انتهای ۳ را جدا می کند. آنزیم tRNA نوکلئوتیدیل ترانسفراز توالی -CCA-3 را با مصرف ATP و CTP به مولکولtRNA اضافه می نماید. این فرایند در سیتوپلاسم صورت می گیرد.

تغییرات نوکلئوتیدی در مولکولtRNA اغلب به شکل متیلاسیون، دآمیناسیون، احیاء، نوآرایی پیوند بتا-N-گلیکوزیدی می باشد و احتمالا در داخل هسته انجام می شوند. سه تغیر عمده که بر روی یوریدین انجام می شود عبارتند از:

پسودویوریدین، حاصل تجزیه اتصال معمول بتا-N-گلیکوزیدی بین ریبوز و نیتروژن ۱ باز یوراسیل و سپس ایجاد اتصال غیر معمول بین ریبوز و کربن ۵ باز یوراسیل می باشد. ریبوتیمیدین، حاصل متیلاسیون یوریدین می باشد. دی هیدرو یوریدین به واسطه احیاء پیوند دو گانه باز یوراسیل حاصل می گردد. گاهی در ساختمان مولکول های پیش ساز tRNA اینترون وجود دارد (معمولا در ناحیه آنتی کدون) که با پیرایش در انتهای فرایند پردازش برداشت می گردد.

فرضیه وبل: وقتی از نوکلئوتید غیر معمول اینوزینات (I) در اولین موقعیت آنتی کدون (۵) استفاده می شود، امکان ایجاد جفت باز I با یکی از سه نوکلئوتید A، U و C وجود دارد و حداکثر سه کدون توسط مولکول tRNA قابل شناسایی است.

پردازش RNAهای ریبوزومی

در تمامی موجودات رونوشت های اولیه rRNA به صورت مولکول های بزرگی تولید می شوند که به دنبال پردازش منجر به تولید چندین مولکول rRNA بالغ می گردند. این فرایند پردازش شامل متیلاسیون، تجزیه اندونوکلئازی، تجزیه اگزو نوکلئازی است. واکنش های متیلاسیون قبل از تجزیه و برداشت نوکلئوتیدهای اضافی صورت می پذیرد.

مهار کننده‌های آنزیم RNA پلیمراز

ریفامپین و استرپتولیگیدین ها: با اتصال به زیر واحد بتا آنزیمRNA پلیمراز پروکاریوتی آن را مهار می نماید.

آلفا آمانیتین: در غلظت های بسیار پایین با مهار زیر واحد بزرگ آنزیم RNA پلیمراز ۲ مانع از تولید mRNA میشود. در غلظت های بالاتر، RNA پلیمراز ۳ نیز مهار می شود، در حالی که RNA پلیمراز ۱ تحت تاثیر آلفا آمانیتین قرار نمی گیرد.

مکانیسم های ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری ها

مقاومت به پنی سیلین ها و سفالوسپورین ها: توسط آنزیم های بتالاکتاماز کد شده توسط پلاسمید غیر فعال می شوند.

مقاومت به آمینوگلیکوزیدها: توسط آنزیم های فسفوترانسفراز کد شده توسط پلاسمید غیر فعال می شوند.

مقاومت به کلرامفنیکل: توسط آنزیم کلرامفنیکل استیل ترانسفراز کد شده توسط پلاسمید غیر فعال می شود.

مقاومت به اریترومایسین: RNA متیلاز کد شده توسط پلاسمید با تبدیل یک آدنوزین در۲۳SrRNA به N6-دی متیل آدنوزین آن را غیر فعال می کند. سنتزRNA متیلاز توسط اریترومایسین القا می شود. وقتی جایگاه های مشابه ریبوزومی به لینکومایسین و کلیندامایسین متصل شوند باعث مقاومت متقاطع به این آنتی بیوتیک ها نیز می شود.