روش‌های بررسی مغز
یکی از مهم‌ترین روش های پژوهشی که برای بررسی کارکردهای مغز بکار می‌رود، شامل تخریب بخشی از مغز و بررسی رفتار متعاقب جانور است. این روش، قطع تجربی نامیده می‌شود. در اکثر موارد، قطع تجربی شامل برداشتن بافت مغزی نیست، بلکه پژوهشگر، یک بافت را در محل آن تخریب می کند. قطع تجربی، قدیمی ترین روش بکار گرفته شده در علم عصب شناسی است و امروزه نیز مهم ترین روش به حساب می‌آید.
بررسی اثرات رفتاری آسیب مغزی
ضایعه، زخم یا جراحت است و پژوهشگری که به تخریب بخشی از مغز می پردازد، معمولاً با عبارت ضایعه مغزی از آسیب وارد شده به مغز یاد می کند. آزمایش هایی که در آن ها بخشی از مغز آسیب می بیند و به دنبال آن، رفتار حیوان مورد مشاهده قرار می گیرد، مطالعه ضایعات نامیده می شوند. منطق مطالعه ضایعه این است که کارکرد یک ناحیه مغز می تواند از رفتارهایی استنتاج شود که حیوان دیگر قادر نیست پس از آسیب دیدن آن ناحیه، دیگر قادر به انجام آن ها نیست. مثلاً اگر پس از تخریب بخشی از مغز، حیوان دیگر نتواند کارهایی را که مستلزم بینایی است، انجام دهد، می توانیم نتیجه بگیریم که حیوان کور شده است و ناحیه آسیب دیده در بینایی نقش دارد.
باید در تفسیر اثرات ضایعه مغزی، بسیار محتاط باشیم. مثلاً چگونه می توانیم اطمینان حاصل کنیم که حیوان دچار ضایعه، کور است؟ آیا با اشیا برخورد می کند، یا این که از حرکت در یک ماز به سمت نوری که مکان غذا را نشان می دهد، خودداری می کند، یا این که دیگر مردمک چشم هایش در مقابل نور تنگ نمی شود؟ حیوان، ممکن است به علت نقص در هماهنگی حرکتی به اشیاء برخورد کند، یا اشتهایش را به غذا از دست داده باشد، یا این که خیلی خوب ببیند، اما بازتاب های بینایی اش را از دست داده باشد. پژوهشگران اغلب دچار اشتباه می شوند. سال ها پیش تصور کردند که موش آلبینو، کور است (این موش، کور نیست). تصورش را بکنید، چگونه می توانید آزمایش کنید که یک موش می تواند ببیند یا نه؟ بخاطر داشته باشید که موش‌ها حس‌گرها (سبیل هایی) دارند که می تواند برای شناسایی یک دیوار، پیش از برخورد کردن با آن یا شناسایی لبه میز، پیش از فرو افتادن از آن بکار رود. آن ها هم چنین می توانند راه خود را در یک اتاق از طریق دنبال کردن ردّ بویایی پیدا کنند. پس چه چیزی می توانیم از مطالعات ضایعه بیاموزیم؟ هدف ما کشف کارکردهایی است که بوسیله نواحی مختلف مغز انجام می گیرد و سپس فهم چگونگی ترکیب این کارکردها در جهت انجام رفتارهای خاص است. تفاوت بین کارکرد مغزی و رفتار، حائز اهمیت است. مدارهای درون مغز، کارکردها را انجام می دهند، نه رفتارها را. هیچ ناحیه‌ای از مغز یا هیچ یک از مدارهای عصبی، به تنهایی مسئول یک رفتار نیست. هر ناحیه کارکرد (یا مجموعه‌ای از کارکردها) را به انجام می رساند که در اجرای رفتار شرکت دارند. مثلاً عمل خواندن شامل کارکردهای لازم برای کنترل حرکات چشم، تمرکز عدسی های چشم، ادراک و تشخیص کلمات و حروف، درک معنی واژه ها و غیره می باشد. بعضی از این کارکردها در رفتارهای دیگری نیز شرکت می کنند، مثلاً کنترل حرکات چشم و تمرکز، برای هر نوع کاری که مستلزم نگاه کردن است، ضروری می باشد و آن دسته از ساز و کارهای مغز که برای درک معانی کلمات بکار می روند، در درک کلام نیز شرکت دارند. وظیفه پژوهشگر، فهم کارکردهای ضروری برای انجام یک رفتار خاص و تعیین این مسأله است که چه مدارهایی از نورون ها در مغز، مسئول هر کدام از این کارکردها است.
ایجاد ضایعات مغزی
ما چگونه ضایعات مغزی را ایجاد می کنیم؟ تخریب بخش هایی از مغز که درست زیر جمجمه قرار گرفته‌اند، آسان است. حیوان را بیهوش می کنیم، پوست سر را بریده و باز می کنیم، بخشی از جمجمه را بر می داریم، سخت شامه را بریده و قشر مخ را در معرض دید قرار می دهیم. سپس می توانیم از یک وسیله مکشی برای بیرون کشیدن بافت مغز استفاده کنیم. برای تکمیل برداشت این بافت، یک پیپت شیشه‌ای را روی سطح مغز قرار داده و بوسیله تلمبه مکنده متصل به پیپت، بافت مغز را بر می داریم. ما بیشتر می خواهیم آن نواحی مغز را که در عمق مغز قرار گرفته‌اند، تخریب کنیم. ضایعات نواحی زیر قشری مغز (آن نواحی که در زیر کرتکس قرار گرفته‌اند) معمولاً با عبور دادن جریان الکتریکی بوسیله سیمی از فولاد ضدزنگ انجام می شود که در همه نقاط به جز قسمت نوک بوسیله لایه‌ای عایق پوشیده شده است. این سیم را بصورت استریو تاکسیک طوری هدایت می کنیم که انتهای آن در محل مناسب قرار گیرد (جراحی استریوتاکسیک در بخش بعدی توصیف شده است). سپس دستگاه ضایعه ساز را که جریان فرکانس رادیویی (RF)- جریان متناوبی با فرکانس بسیار بالا- تولید می کند، روشن می کنیم. عبور جریان از بافت مغز گرمایی ایجاد می کند که سلول های واقع در ناحیه اطراف نوک الکترود را از بین می برد. ضایعات ایجاد شده بدین وسیله، همه چیز را در اطراف نوک الکترود، از جمله اجسام سلولی عصبی و آکسون های نورون هایی که از آن ناحیه عبور می کنند، از بین می برد. یک روش گزینشی تر برای ایجاد ضایعات مغزی، استفاده از یک اسید آمینه تحریکی، از قبیل اسید کاینیک است که با تحریک نورون ها تا حد مرگ شان، آن ها را از بین می برد. ضایعات ایجاد شده به این شیوه، ضایعات تحریکی-تخریبی نامیده می شوند. وقتی یک اسید آمینه تحریکی از طریق لوله به ناحیه‌ای از مغز تزریق شود، این ماده شیمیایی اجسام سلولی عصبی آن ناحیه را تخریب می کند، اما آکسون های متعلق به نورون های مختلفی را که از آن جا عبور می کنند، به حال خود رها می کند. این امکان انتخاب به پژوهشگر اجازه می دهد تعیین کند که آیا اثرات رفتاری تخریب ساختار خاصی از مغز در اثر از بین رفتن نورون های قرار گرفته در آن ناحیه ایجاد شده است یا در اثر تخریب آکسون هایی که از آن جا عبور می‌کنند.
توجه داشته باشید که هنگام ایجاد ضایعات زیر قشری بوسیله عبور جریان RF از طریق یک الکترود یا تزریق یک ماده شیمیایی از طریق لوله، همواره آسیبی اضافی به مغز وارد می کنیم. وقتی الکترود یا لوله را وارد مغز می کنیم تا به ناحیه مورد نظر خود برسیم، به ناچار، حتی پیش از روشن کردن دستگاه ضایعه ساز یا شروع تزریق، آسیب اندکی ایجاد می کنیم. بنابراین نمی توانیم صرفاً به مقایسه رفتار حیوانات دچار ضایعه مغزی با رفتار حیوانات جراحی نشده گروه کنترل اکتفا کنیم. آسیب جزئی به نواحی مغزی بالای ناحیه دچار ضایعه ممکن است علت برخی از نقیصه های رفتاری‌ای باشد که مشاهده می کنیم. آن چه روی گروه آزمایشی انجام می دهیم، روی گروه کنترل نیز پیاده می‌کنیم و روی آنها ضایعات کاذب ایجاد می‌کنیم. برای این کار حیوان را بیهوش می کنیم، در دستگاه استریوتاکسیک (که در زیر توصیف شده است) قرار می دهیم، پوست سر را باز می کنیم، در جمجمه سوراخ هایی ایجاد می کنیم، الکترود یا لوله را وارد مغز می کنیم و آن را تا عمق مورد نظر فرو می بریم. به دیگر سخن، همه کارهایی را که برای ضایعه انجام می دهیم، به جز روشن کردن ضایعه ساز یا شروع تزریق در این جا نیز اجرا می کنیم. این گروه حیوانات نقش گروه کنترل را دارد. اگر رفتار حیوانات دچار ضایعات مغزی با رفتار حیوانات کنترل دارای ضایعه کاذب تفاوت داشته باشد، می توانیم نتیجه‌گیری کنیم که ضایعه، علت نقیصه های رفتاری است (همان گونه که می بینید، یک ضایعه کاذب همان نقش دارونما را در یک مطالعه داروشناسی بازی می کند). اکثر اوقات، پژوهشگران ضایعات مغزی دائمی ایجاد می کنند، اما گاهی مفید است که فعالیت ناحیه ویژه‌ای از مغز را بطور موقت، متوقف کنیم. آسان ترین راه برای انجام این کار، تزریق بی حس کننده موضعی یا ماده‌ای بنام موسیمول به قسمت مورد نظر مغز است. داروی بی حس کننده، از ورود پتانسیل های عمل آکسون ها به ناحیه موردنظر و خروج آن ها از این ناحیه جلوگیری می کند، در نتیجه به طور مؤثر، یک ضایعه موقتی ایجاد می کند (که معمولاً ضایعه قابل بازگشت مغزی نامیده می شود). موسیمول دارویی است که گیرنده های گابا را تحریک می کند و یک ناحیه از مغز را با بازداری نورون های قرار گرفته در آن ناحیه، غیرفعال می کند (بخاطر داشته باشید که گابا مهم ترین انتقال دهنده عصبی بازدارنده در مغز است).
جراحی استریوتاکسیک
حال، ما چگونه نوک الکترود یا لوله را به یک موقعیت دقیق در اعماق مغز حیوان می رسانیم؟ پاسخ، جراحی استریوتاکسیک است. استریوتاکسیک در لغت به معنی «محکم قرار گرفتن» است. بصورت تخصصی تر، این لغت به توانایی مکان یابی اشیا در فضا اشاره دارد. یک دستگاه استریوتاکسیک دارای یک نگهدارنده است که سر حیوان را در یک موقعیت استاندارد ثابت می کند و نیز یک بازوی متحرک دارد که الکترود یا لوله را به اندازه مسافت های معین در هر سه بعد فضایی حرکت می دهد. با این حال، برای انجام جراحی استریوتاکسیک باید اطلس استریوتاکسیک را مطالعه نمود.
اطلس استریوتاکسیک
مغز هیچ دو حیوان متعلق به یک گونه خاص، کاملاً یکسان نیستند، اما بین افراد آنقدر شباهت هست که بتوان موقعیت ساختارهای ویژه مغز را نسبت به اجزای خارجی سر تعیین کرد. بعنوان نمونه هسته زیر قشری یک موش ممکن است از نقطه‌ای که بوسیله اتصال چند استخوان جمجمه شکل گرفته است، در جهت بطنی، قدّامی و جانبی، چند میلی متر فاصله داشته باشد. جمجمه از چندین استخوان تشکیل شده است که بهم متصل شده و اتصال ها(درزها) را شکل می دهند. سر نوزادان تازه متولد شده دارای یک محل نرم در محل اتصال استخوان های تاجی و سهمی بنام ملاج می باشد. پس از آن که این شکاف بسته شد، محل اتصال این استخوان ها، برگما نامیده می شود که از واژه‌ای یونانی به معنی «جلوی سر» گرفته شده است. می توانیم برگما را روی جمجمه موش نیز پیدا کنیم و این نقطه، نقش یک نقطه مرجع مناسب را دارد. یک اطلس استریوتاکسیک شامل عکس ها یا طراحی هایی است که با برش های پیشانی متعلق به فواصل مختلفی از جلو و عقب برگما مطابقت دارند. هر صفحه اطلس استریوتاکسیک، طبق فاصله آن از برگما برچسب گذاری شده است. شبکه ترسیم شده در هر صفحه فواصل ساختارهای مغزی را در جهت بطنی از بالای جمجمه، و در جهت جانبی نسبت به خط‌میانی نشان می‌دهد. برای قراردادن نوک سیم در فورنیکس باید در بالای ساختار موردنظر سوراخی ایجاد کرده و الکترود را از درون سوراخ پایین بیاوریم تا این که نوک آن نسبت به ارتفاع جمجمه در برگما، در عمق مناسب قرار گیرد. سپس، با یافتن ساختار عصبی موردنظر در یکی از صفحات اطلس استریوتاکسیک (که در حیوان قابل مشاهده نیست)، می توانیم موقعیت ساختار را نسبت به برگما (که می توانیم ببنیم) تعیین کنیم. توجه داشته باشید که به دلیل تفاوت هایی در نژادها و سنین حیوانات، اطلس فقط یک موقعیت تقریبی را ارائه می کند. ما همیشه باید مجموعه جدیدی از مختصات را بکار گیریم، مغز حیوان را شکافته و رنگ آمیزی کنیم، موقعیت دقیق ضایعه را مشاهده کنیم، اعداد را تصحیح کنیم و دوباره امتحان کنیم (برش و رنگ آمیزی مغز نیز بعداً توصیف خواهند شد).
دستگاه استریوتاکسیک
یک دستگاه استریوتاکسیک روی اصول ساده‌ای کار می کند. این وسیله دارای یک نگهدارنده سر است که جمجمه حیوان را در جهت مناسبی نگه می دارد، یک نگهدارنده الکترود و یک مکانسیم مدرج دارد که نگهدارنده الکترود را در فواصل اندازه گیری شده‌ای در جهت سه محور عقب-جلو، پشتی-شکمی و جانبی-میانی حرکت می‌دهد. پس از آن که مختصات را از اطلس استریوتاکسیک به دست آوردیم، حیوان را بیهوش می‌کنیم، آن را در دستگاه قرار می دهیم و پوست سرش را برمی داریم. برگما را پیدا می کنیم، شماره های مناسب را در دستگاه استریوتاکسیک تنظیم می کنیم، روی جمجمه حفره‌ای ایجاد می کنیم و وسیله را به اندازه مناسب در مغز فرو می بریم. حال، نوک لوله یا الکترود همان‌جایی که ما می خواهیم قرار دارد و آماده‌ایم تا ضایعه را ایجاد کنیم. البته جراحی استریوتاکسیک ممکن است در جهت اهدافی غیر از ایجاد ضایعه بکار رود. سیم هایی که در مغز قرار می گیرند، ممکن است برای تحریک نورون ها و نیز تخریب آن ها بکار روند و می توان داروهایی تزریق کرد که نورون ها را تحریک کنند، یا این که گیرنده های خاصی را مسدود کنند. می توانیم لوله ها یا سیم ها را بطور دائمی به مغز متصل کنیم. در همه این موارد پس از انجام عمل جراحی، زخم بخیه زده می شود و حیوان از دستگاه استریوتاکسیک بیرون برده شده و از بیهوشی خارج می شود. ضمناً دستگاه های استریوتاکسیک مخصوص انسان ها نیز ساخته شده است. گاهی یک جراح اعصاب، مثلاً برای کاهش علائم بیماری پارکینسون، ضایعات زیر قشری ایجاد می کند. جراح، معمولاً از چند نشانه استفاده کرده و موقعیت سیم (یا وسیله دیگر) وارد شده به مغز را با استفاده از اسکن های MRI، پیش از ایجاد ضایعه تثبیت می کند.
Stereotaxic surgery (جراحی استریئو تاکسی)
همانگونه که در شکل ملاحظه می‌کنید دستگاه استرئوتاکس از بخش های مختلفی برای نگه داشتن و جراحی موش تشکیل شده است. این دستگاه دارای سه کولیس عمود بر هم (۳ و ۲و ۱) می باشد که برای پیدا کردن دقیق نقاط خاصی از جمجمه و تزریق در مغز به کار می روند. Ear bars (۵) میله هایی هستند که در داخل گوش های موش قرار می گیرند و باید به وسیله رفلکس پلک زدن مطمئن شد که در جای مناسب خود قرار دارند که در این صورت جمجمه ی موش به صورت کاملاً افقی قرار گرفته است. Nose cramps (۴) نیز قسمتی است که بینی موش را محکم نگه می دارد تا موش نتواند تکان بخورد. در قسمتی که با شماره ی ۶ مشخص شده می توان وسیله ی علامت گذاری بر روی جمجمه و یا سرنگ تزریق را نصب نمود.
پس از اینکه موش به صورت صحیح در جای خود قرار داده شد، پوست سر را به صورت عمودی برش می دهیم تا سطح جمجمه نمایان شود. همانگونه که در شکل نیز مشاهده می کنید دو نقطه بر روی جمجمه وجود دارد که از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند. برای انجام هر تست قبل از هر چیز لازم است تا سوزنی را که در ناحیه ۶ نصب کرده ایم دقیقا بر روی نقاط Bregma ،Lambda تنظیم کنیم و مختصات دقیق این نقاط را از روی کولیس ها خوانده و آنها را یادداشت کنیم. سپس برای یافتن ناحیه ی تزریق، نوک سوزن را براساس مختصاتی که در اطلس مغز موش واتسون (Rat brain atlas of Paxinos & Watson) نوشته شده است. به نقطه ی مورد نظر جابه جا کرده و علامت گذاری می کنیم. (مثلات در این اطلس نوشته شده که برای تزریق در ناحیه هیپوکامپ از نقطه ی لامبدا x میلیمتر به سمت بالا و y میلیمتر به طرفین رفته و تزریق را در عمق z میلیمتر انجام دهید. دلیل اینکه می گویند به طرفین این است که هیپوکامپ هم در نیم کره راست و هم در نیم کره ی چپ وجود دارد!!) پس از علامت گذاری، نقطه ی مورد نظر را با مته سوراخ کرده و بسته به نوع تست تزریق را با متدهای مختلفی که وجود دارد انجام می دهیم.
همانگونه که قبلا گفته شد، حافظه دارای سه مرحله ی اکتساب (Acquisition)، ذخیره سازی یا تثبیت (Storage or consolidation) و بازیابی (Retrieval) می باشد. اگر داروی مورد نظر ما قبل از یک تست یادگیری ( مثلا ۴ day morris water maze) به موش تجویز شده باشد و پس از انجام تست تغییراتی را در حافظه نشان دهد. می توان ادعا کرد که این دارو در مرحله ی اکتساب اثر گذار بوده است. اما اگر بخواهیم تاثیر دارو را بر مرحله ی تثبیت بررسی کنیم لازم است این تزریقات پس از هر بار یادگیری یعنی بلافاصله بعد از هر بلاک انجام شود. (یعنی بعد از اینکه موش را چهار بار داخل آب انداختیم و هر بار سکو را پیدا کرد تزریق داخل مغز موش انجام می شود).
اگر بخواهیم مرحله ی بازیابی حافظه را مورد بررسی قرار دهیم باید پس از طی دوره ی چهار روزه ی یادگیری. زمانی که می خواهیم آزمون نهایی حافظه را انجام دهیم.( مثلا دو هفته یا یک ماه بعد از یادگیری) دقیقا قبل از انجام تست تزریق را انجام دهیم.
مطابق آنچه گفته شد برای بررسی اثر دارو بر مرحله اکتساب می توان تزریق دارو در مغز را مستقیما در هنگام جراحی انجام داده و پس از آن تست ها را انجام دهیم اما در مورد بررسی مراحل تثبیت و بازیابی اینگونه نیست. (برای اینکه انجام جراحی stereotaxic کار دشواری است و احتمال تلف شدن حیوان نیز وجود دارد و نمی توان در حین یادگیری مرتبا این کار را انجام داد). برای رفع این مشکل قبل از هر چیز جراحی را انجام می دهیم ونقاط مورد نظر را با مته سوراخ می کنیم. سپس سر سوزن های معمولی به طول سه میلیمتر را در این سوراخ ها قرار داده و به وسیله ی سیمان دندانپزشکی آن را بر روی جمجمه ی موش کاملا فیکس می کنیم تا بتوانیم قبل از تست یا بعد از هر بلاک به سادگی تزریق را انجام دهیم. (به عبارتی در جمجمه کانال می گذاریم. در انجام تست های یادگیری باید دقت کرد که فاصله ی زمانی بین جراحی تا انجام تست باید حداقل بین ۶-۵ روز باشد. زیرا داروهای بیهوشی می توانند روی فاز یادگیری تاثیرگذار باشند. (خیلی از داروهای بیهوشی آنتاگونیست NMDA هستند).
دربسیاری از مواردهدف از این قبیل تست ها به دست آوردن نتایج رفتاری است اما در برخی موارد پس از انجام تست بررسی هایی از جملهimmunohistochemistry بر روی بافت مغز نیز انجام می شود.Immunohistochemistry روشی است که می توان با استفاده از آنتی بادی های ضد پروتئین های خاص (مثلا رسپتورهای کولینرژیک) میزان و نقشه ی افزایش یا کاهش این پروتئین ها را بررسی کرد که میتواند نشان دهنده اثر دارو باشد. (برای مثال شکل مقابل نشان دهنده ی کاهش بیان پروتئین های خاص در اثر بیماری شیزوفرنی می باشد).
برای انجام immunohistochemistry لازم است تا بافت مغز را به صورت دست نخورده و فیکس شده داشته باشیم. برای فیکس کردن کامل مغز ماده ی fixator را به داخل قلب تزریق می کنیم تا آن را به تمام قسمت های مغز پمپ کند. روش دیگری نیز برای مشاهده ی تغییرات بیان پروتئین ها به نام western block test وجود دارد که تنها میزان تغییرات را نشان می دهد و نه مکان تغییرات.
ضمیمه (روش کار با کولیس)
کولیس از ترکیب یک خط کش مدرج و یک ورنه متحرک ساخته شده است. خط کش برحسب میلیمتر مدرج شده و ورنیه دارای درجه بندی کوچکی است که اغلب شامل ۱۰ قسمت است و به سادگی می توان با این وسیله تا ۰٫۱ میلیمتر را اندازه گرفت. روش خواندن کولیس به این صورت است که درجات را از روی خط کش (عددی که صفر ورنیه در مقابل آن قرار دارد و یا از آن گذشته است) و کسر درجات را از روی ورنیه می خوانند . برای خواندن کسر درجات، درجه ای از درجات ورنیه را پیدا می کنند که درست در برابر یکی از درجات خط کش قرار گرفته است. شکل مقابل کولیسی را نشان می دهد که نمایانگر عدد ۱۵.۸mm می باشد.
