تکنیک‌های بیوتکنولوژی در تولیدمثل و ناباروری

تکنیک‌های بیوتکنولوژی در تولیدمثل و ناباروری

پیشگفتار

بیوتکنولوژی در حوزه‌ی باروری و ناباروری پیشرفت‌های چشمگیری داشته و علی رغم تصور عموم، این حوزه نه‌تنها تولیدمثل انسان‌ها را شامل می‌شود، بلکه در زمینه پرورش حیوانات هم کاربرد وسیعی دارد. در ادامه تکنیک‌ها و زمینه‌هایی که بیوتکنولوژی تولیدمثل در آن‌ها نقش پررنگ و موثری دارد را بررسی می‌کنیم. این روش‌ها هم برای انسان‌ها و هم حیوانات قابل انجام هستند؛ اما برخی از این تکنیک‌ها به دلیل روشن نبودن میزان خطرات و احتمال بروز عوارض جانبی و همچنین برخی شبهات اخلاقی، برای انسان‌ها مورداستفاده قرار نمی‌گیرند.

تعیین جنسیت مایع سمینال

این تکنولوژی به منظور تولید زاده‌هایی با جنسیت دلخواه با استفاده از تعیین جنسیت اسپرم به کار برده می‌شود که برای پرورش‌دهندگان حیوانات کاربرد دارد. این تکنیک براساس اصول فلوسایتومتری انجام می‌شود؛ به این صورت که اسپرم‌های دارای کروموزوم X نشان دار شده با ماده‌ی فلورسنت از اسپرم‌های دارای کروموزوم Y نشان دار شده فلورسنت جدا می‌شوند. این تکنولوژی قادر است ۱۰۰.۰۰۰ اسپرم را در ثانیه آنالیز و ۷۰.۰۰۰ اسپرم را در ثانیه دسته بندی کند. دقت این تکنولوژی در تشخیص جنسیت گاو، ۸۵ تا ۹۵% می‌باشد. گرچه تعداد اسپرم‌های دسته‌بندی شده نسبت به مقدار طبیعی کمتر است، اما نرخ بارداری با استفاده از روش in vivo به صورت تلقیح عمیق در رحم به میزان قابل قبولی می‌رسد. این روش می‌تواند برای انسان هم قابل استفاده باشد اما به دلیل مسائل اخلاقی و انسانی، انجام نمی‌شود.

مزایا: قابل استفاده در برنامه‌های اصلاح نژادی، افزایش تولید موجودات با جنسیت دلخواه با توجه به کاربرد آن‌ها، کاهش احتمال بروز بیماری‌های وابسته به جنس، حفظ و مراقبت از نژاد حیوانات برتر و یا کمیاب
معایب: کاهش تعداد اسپرم در هنگام تلقیح، آسیب دیدگی تعداد زیادی از اسپرم‌ها مانند ناپایدار شدن غشاء اسپرم و ناتوان شدن اسپرم که موجب کاهش طول عمر اسپرم در طی پیمودن مسیر دهانه رحم تا تخمدان می‌شود.

انکپسوله کردن اسپرم

انکپسوله کردن اسپرم به منظور افزایش مدت زمان حفظ و نگهداری اسپرم در شرایط in vitro انجام می‌شود. این تکنولوژی به منظور افزایش طول عمر اسپرم در دمای بدن و توانایی آزاد شدن تصاعدی و مداوم اسپرم‌های زنده طی چند روز در حیوانات اهلی و همچنین انسان طراحی شد. تاکنون اسپرم گوساله با روش میکروانکپسوله کردن و با استفاده از ترکیباتی همچون کلسیم آلژینات، CS-pDADMAC، پلی -L- لایزین، پلی وینیل آمین و پروتامین سولفات به عنوان غشاء حفظ شده است. اندازه‌ی کپسول اسپرم بین ۷۵/۰ تا ۵/۱ میلی متر و با غلظت ۴۵-۱۵۰ میلیون در میلی لیتر متغیر است. طبق مطالعات انجام شده، کپسول‌های برپایه ی CS-pDADMAC، بیشترین نرخ تحرک را نسبت به سایر پلیمرها به اسپرم می‌بخشند.

Sperm transcriptomics

ترانسکریپتومیکس شامل مطالعه‌ی mRNA در مراحل مختلف تکوینی از جمله اسپرماتوژنز است. اسپرم‌ها ژن‌های والدی و همچنین بقایای mRNA‌های مرحله‌ی اسپرماتوژنز را به تخمک می‌رسانند. این ترانسکریپت‌ها با فرآیندهای سلولی و بیولوژیکی مختلفی درارتباط هستند. شناسایی این ترانسکریپت ها با استفاده از microarray یا NGS، در مطالعات آنالیز پروفایل بیانی mRNAهای اسپرم و پلی موفیسم در ژن‌های مرتبط ابزار موثری است. طبق مطالعات انجام شده، پروفایل بیانی ترانسکریپت ها بین گاوهای نر با قابلیت باروری بالا و گاوهای نر با قابلیت باروری پایین متفاوت است؛ به گونه‌ای که ترانسکریپت ها برای پروتئین‌های غشایی و فضای خارج سلولی در گاوهای بارور غلظت بالاتری دارد. این ترانسکریپت ها شامل پروتامین ۱، کازئین بتا ۲ و مولکول thrombospondin receptor CD36 است. این مطالعات باید راه را برای شناسایی تغییرات ترانسکریپتومی ‌براثر اسپرماتوژنزهای غیرطبیعی هموار سازد و همچنین به عنوان بیومارکرهای باروری استفاده شود.

بیومارکرهای مایع سمینال

پیشرفت‌های علم پروتئومیکس و ژنومیکس موجب شناسایی بیومارکرهای متنوعی در مایعات بدن از جمله مایع سمینال شده است که قابلیت پیش بینی توانایی باروری را به ما می‌دهد. بعضی از بیومارکرهای مایع سمینال برای این منظور شامل آنتی ژن‌های مرتبط با باروری، پروتئین‌های خانواده‌ی CATSPER، پروتئین‌های ترشحی غنی از سیستئین، A-kinase anchor protein 4، آنتی ژن CD9، سیتوکروم P450 آروماتاز، کاتپسین D، آلفا -L- فوکوزیداز، فسفولیپاز A2، اسپرم ادهسین Z13، کلاسترین، استئوپونتین، پروتئین‌های متصل شونده به هپارین یا ژلاتین، و PDC-109-like protein می‌باشند. این پروتئین‌ها برای تحرک طبیعی اسپرم و باروری جنس نر حیاتی هستند. تشخیص گاوهای نر بارور با این روش، موجب بالا رفتن نرخ بارداری‌های موفق شده و درنهایت میزان تولید و پرورش زاده‌ها بالاتر می‌رود.

برداشت تخمک

روشی غیرتهاجمی‌و تکرارپذیر که به منظور احیا و بازیافت کردن تخمک‌های مناسب از فولیکول‌های جانوران زنده به کار برده می‌شود. تولید رویان از تخمک‌های برداشت شده تحت تاثیر سن، فصل، هورمون FSH است و می‌تواند به طور متوسط منجر به تولید ۱-۳ رویان از تخمک‌های برداشته شده در هر جلسه شود. این روش می‌تواند برای استفاده از حیوانات برتر به عنوان اهداکننده‌ی تخمک در روند انتفال جنین استفاده شود. این روش نه‌تنها کارایی باروری در طول عمر را بالا می‌برد، بلکه در مطالعات پیچیدگی‌های مولکولی و نقش سایتوکاین‌های مختلف در طی فولیکوژنز ابزار مهمی به شمار می‌رود. از معایب این روش، پایین بودن بازده تخمک بر حسب تخمدان است.

In Vitro Maturation, Fertilization and Culture (IVMFC)

این روش شامل جمع آوری تخمک از تخمدان‌های حیوانات کشتارگاه یا از حیوانات زنده است که در ادامه، در شرایط in vitro به بلوغ رسیده و بارور می‌شوند تا زاده‌های زیستا تولید شوند. تولید گوساله به روش باروری در شرایط in vitro یا همان IVF برای اولین بار در سال ۱۹۸۱ انجام شد. IVMFC منبع خوب رویان برای استفاده در انتقال رویان، کلونینگ، ترانسژن کردن و سایر تکنیک‌های پیشرفته‌ی in vitro فراهم می‌کند. این روش همچنین آنالیز احتمال نمو رویان‌ها، الگوی بیان ژن، مودیفیکیشن‌های اپی ژنتیک و اختلالات سیتوژنتیک را در گونه‌های اهلی مختلفی ممکن ساخته است که به عنوان مدل برای مطالعات رویانی انسان به کار می‌روند.

Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI)

ICSI یک تکنیک دست‌ورزی در مقیاس میکرو است که برای درمان ناباروری جنس نر به کار برده می‌شود. این تکنیک شامل الحاق مکانیکی اسپرم انتخابی به داخل سیتوپلاسم تخمک به منظور تولید رویان مطلوب است. این روش همچنین به مشخص شدن مراحل مختلف باروری کمک کرده و در سیستم انتقال ژن با استفاده از اسپرم به عنوان وکتور هم استفاده می‌شود.

Embryo Cryopreservation

برای سرماداری (Cryopreservation) رویان‌ها، معمولاً روش‌های تعادلی سنتی شامل سیستم‌های فریز کردن همراه با نرخ کنترل شده‌ی سرمادهی و گلیسرول در محیط مخصوص سرماداری استفاده می‌شوند. گرچه نرخ حاملگی در این روش و با استفاده از رویان‌های فریز شده، پایین است. برای حل این مشکل، پروتکل جدیدی ارائه شده و در متد جدید از محلول غلیظ حاوی عوامل حفظ در سرما استفاده می‌شود که شامل گلیسرول، اتیلن گلیکول و عوامل غیر نفوذکننده مثل سوکروز، گلوکز و فروکتوز در طی روند استفاده می‌شود. از مزایای این روش کاهش ریسک و هزینه‌ها در انتقال جانوران گران قیمت، کاهش انتقال بیماری‌ها و حفظ جرم پلاسم(Germplasm) گونه‌های درمعرض خطر می‌باشد.

Embryo Sexing

تعیین جنسیت رویان تکنیکی است که در بیوتکنولوژی تولیدمثل کاربردهای عملیاتی بالایی دارد. روش‌های مختلفی به این منظور استفاده می‌شوند از جمله نمونه برداری یا آسپیراسیون سلول‌ها. برای این تکنیک رویان‌ها در روز هفتم جمع آوری می‌شوند و در بافر سالین شستشو داده می‌شوند. فقط رویان‌های عالی و خوب نمونه بردارمی‌دهدوند. معمولاً ۸-۱۰ سلول جمع آوریمی‌انجامد سپس حدوداً ۵ ساعت برای تعیین جنسیت زمان نیاز است. تعیین جنسیت توسط تکنولوژی DNA پروصرفاًیه کروموزوم Y انجام می‌شود که با استفاده از PCR، نواحی مربوط به کروموزوم Y تکثیر و شناسایی می‌شوند. روش‌های دیگر شامل شناسایی آنتی ژن H-Y رویانی است که با تکنیک‌های loop-mediated isothermal amplification و ارزیابی مبتنی بر PCR مضاعف (duplex PCR-based assay) انجام شده و تا ۹۵% دقت دارند اما هزینه بر هستند.

Embryogenomics

امبریوژنومیکس شامل مطالعه‌ی بیان ژن ها در مراحل تکوینی مختلف رویان و در شرایط محیطی طبیعی و جایگزین است. با استفاده از این روش، آبشار رویدادها طی فعالسازی ژنوم رویانی و تکوین قابل مطالعه است و این مطالعات برای مسائلی چون تمایز اولیه، کاشت موفق و تکوین جنین بسیار سودمند هستند. تحقیقات مختلفی برروی بیان مارکرهای ژنی همچون:

glucose transporter Type 1، heat shock protein HSPA-1A، MATER، zygote arrest 1، growth differentiation factor 9،leukemia inhibitory factor، bone morphogenetic protein 15 embryos/oocyte

انجام شده است. آنالیز ژن ها به انتخاب مارکرها برای تعیین کیفیت و میزان نرمال بودن رویان ها کمک می‌کند که با توجه به ارزیابی ها می‌توان تکنیک‌های بیوتکنولوژیک مناسب را انتخاب کرد و به کار برد.

Somatic Cell Nuclear Transfer

انتقال هسته سلول ها سوماتیک، که به آن کلونینگ هم گفته می‌شود، شامل به کارگیری تکنیک‌های دست‌ورزی در مقیاس میکرو و همجوشی سلول هاست که به این طریق انتقال بلاستومر از یک جنین چندسلولی و یا سلول سوماتیک به یک تخمک بدون هسته ممکن می‌شود. این تکنیک برای تکثیر جانوران ممتاز که تنوع ژنتیکی پایینی دارند استفاده می‌شود. کلونینگ حیوانات با هدف تکثیر ژنوتیپ‌های ارزشمند، القای مودیفیکاسیون‌های ژنتیکی و همچنین تولید جانوران ترانسژنیک انجام می‌شود. در فرآیند کلونینگ از سلول‌های بنیادی رویانی (ES cells)، که به آن‌ها nuclear transfer-derived ES cell گفته می‌شود، استفاده می‌شود. انواع مختلفی از سلول‌های سوماتیک به عنوان دهنده استفاده می‌شوند که شامل فیبروبلاست‌های جنینی، فیبروبلاست‌های بالغین، سلول‌های گرانولوزا، هپاتوسیت ها و لنفوسیت ها می‌باشند.
این روش به عنوان ابزاری برای تولید سلول‌های بنیادی به منظور کلونینگهای درمانی نیز استفاده می‌شود. این تکنیک فرصت‌های نوینی را در مهندسی ژنتیک، حفظ تنوع ژنتیکی جانوران، ترمیم بافت و پیشرفت حوزه ی سلول‌های بنیادی تخصصی به عنوان درمان ایجاد کرده است.

ترانسژنیک

حوزه‌ی ترانسژنیک شامل انتقال ژن به درون ژنوم با استفاده از متدهای مختلف است که موجب تولید جانوران ترانسژن می‌شود. روش‌های مختلفی برای انتقال ژن به کار می‌رود که شامل Pro-nuclear microinjection ، وکتورهای مبتنی بر رتروویروس میکرواینجکشن سیتوپلاسمی، انتقال DNA به رویان یا سلول بنیادی با وکتور رتروویروسی، انتقال ژن با واسطه ی اسپرم و همچنین انتقال RNA هستند.
جانوران ترانسژن با هدف تولید شیر دارای هورمون رشد انسانی، میزان کازئین بالا، هموگلوبین انسانی، آنتی ترومبین III و آنتی تریپسین و یا تولید بیشتر پشم تکثیر می‌شوند.

نانوتکنولوژی

درحوزه ی بیولوژی تولیدمثل و باروری، میکروفلوئیدیک و نانوفلوئیدیک ها ابزارهای جدیدی هستند که فرآیند سنتی IVF و IVEP را تسهیل می‌کنند؛ این ابزارها اخیرا در جداسازی اسپرم‌های متحرک در چهارپایان و دست ورزی تخمک در شرایط in vitro استفاده می‌شوند. تولید بیوسنسورها برای برخی بیومارکرها نیز از جمله پیشرفت‌های این حوزه است که به شناسایی موجود برتر و غربالگری بیماری‌های ژنتیکی کمک می‌کند. در جانوران اهلی، این سنسورها با نانوتیوب در زیر پوست قرار می‌گیرند تا تغییرات سطح استرادیول را در خون اندازه گیری کنند. بیوسنسور برای پروژسترون شیر گاو با حد تشخیص ۰ تا ۵ نانوگرم در میلی لیتر ساخته شده است.

منبع:

Choudhary KK, Kavya KM, Jerome A, Sharma RK. Advances in reproductive biotechnologies. Vet World. 2016;9(4):388-95.

انجمن علمی دانشجویی ژنتیک بیوتکنولوژی دانشگاه شهید چمران اهواز شماره جدید فصلنامه «ژنوفیل» شماره چهارم سال دوم

مدیر مسئول: زهرا نصب نجار

سردبیر: آرزو آروند

هیئت تحریریه: دکتر مژگان ترابی، آرزو آروند، زهرا نصب نجار، حسین یزدانی، آمین محمدی، ماندانا عسکری و شیوا مظاهری تهرانی.

نگارنده: ماندانا عسکری

با همکاری: الهه حمیدی