مبانی علوم اعصاب اریک کندل؛ ژن‌ها و رفتار؛ تنظیم ریتم شبانه روزی در مگس ها، موش ها و انسان ها

A Transcriptional Oscillator Regulates Circadian Rhythm in Flies, Mice, and Humans

یک نوسان ساز رونویسی ریتم شبانه روزی را در مگس‌ها، موش‌ها و انسان‌ها تنظیم می‌کند.

The first large-scale studies of the influence of genes on behavior were initiated by Seymour Benzer and his colleagues around 1970. They used random mutagenesis and classical genetic analysis to identify mutations that affected learned and innate behaviors in the fruit fly Drosophila melanogaster: circadian (daily) rhythms, courtship behavior, movement, visual perception, and memory (Box 2-2 and Box 2-3). These induced mutations have had an immense influence on our under- standing of the role of genes in behavior.

اولین مطالعات در مقیاس بزرگ در مورد تأثیر ژن‌ها بر رفتار توسط سیمور بنزر و همکارانش در حدود سال 1970 آغاز شد. آنها از جهش زایی تصادفی و تجزیه و تحلیل ژنتیکی کلاسیک برای شناسایی جهش‌هایی که بر رفتارهای آموخته شده و ذاتی در مگس میوه مگس سرکه مگس سرکه مگس سرکه مگس سرکه مگس سرکه مگس سرکه مگس سرکه (Drosophila melanogaster) تأثیر می‌گذارد، استفاده کردند. روزانه) ریتم، رفتار معاشقه، حرکت، ادراک بصری و حافظه (کادر 2-2 و جعبه 2-3). این جهش‌های القا شده تأثیر زیادی بر درک ما از نقش ژن‌ها در رفتار داشته اند.

Box 2-2 Generating Mutations in Experimental Animals

کادر 2-2 ایجاد جهش در حیوانات آزمایشی

Random Mutagenesis in Flies

جهش زایی تصادفی در مگس‌ها

Genetic analysis of behavior in the fruit fly (Drosophila) is carried out on flies in which individual genes have been mutated. Mutations can be made by chemical mutagenesis or by insertional mutagenesis, strategies that can affect any gene in the genome. Similar random mutagenesis strategies are used to create mutations in the nematode worm Caenorhabditis elegans, zebra fish, and mice.

تجزیه و تحلیل ژنتیکی رفتار در مگس میوه (Drosophila) بر روی مگس‌هایی انجام می‌شود که در آنها ژن‌های فردی جهش یافته است. جهش‌ها می‌توانند با جهش زایی شیمیایی یا جهش زایی درج شوند، استراتژی‌هایی که می‌توانند بر هر ژنی در ژنوم تأثیر بگذارند. استراتژی‌های جهش زایی تصادفی مشابهی برای ایجاد جهش در کرم نماتد Caenorhabditis elegans، ماهی گورخری و موش استفاده می‌شود.

Chemical mutagenesis, for example with ethyl methanesulfonate (EMS), typically creates random point mutations in genes. Insertional mutagenesis occurs when mobile DNA sequences called transposable elements randomly insert themselves into other genes.

جهش زایی شیمیایی، به عنوان مثال با اتیل متان سولفونات (EMS)، معمولاً جهش‌های نقطه ای تصادفی در ژن‌ها ایجاد می‌کند. جهش زایی درج زمانی اتفاق می‌افتد که توالی‌های DNA متحرک به نام عناصر قابل انتقال به طور تصادفی خود را به ژن‌های دیگر وارد می‌کنند.

The most widely used transposable elements in Drosophila are the P elements. P elements may be modified to carry genetic markers for eye color, which makes them easy to track in genetic crosses, and they may also be modified to alter expression of the gene into which they are inserted.

پرکاربردترین عناصر قابل انتقال در مگس سرکه عناصر P هستند. عناصر P ممکن است برای حمل نشانگرهای ژنتیکی برای رنگ چشم اصلاح شوند، که ردیابی آنها را در تلاقی‌های ژنتیکی آسان می‌کند، و همچنین ممکن است برای تغییر بیان ژنی که در آن وارد شده اند، اصلاح شوند.

To cause P element transposition, Drosophila strains that carry P elements are crossed to those that do not. This genetic cross leads to destabilization and transposition of the P elements in the resulting offspring. The mobilization of the P element causes its transposition into a new location in a random gene.

برای ایجاد جابجایی عنصر P، سویه‌های مگس سرکه حامل عناصر P هستند به سویه‌هایی که حامل عناصر P نیستند تلاقی داده می‌شوند. این تلاقی ژنتیکی منجر به بی ثباتی و جابجایی عناصر P در فرزندان حاصل می‌شود. بسیج عنصر P باعث جابجایی آن به یک مکان جدید در یک ژن تصادفی می‌شود.

Targeted Mutagenesis in Mice

جهش زایی هدفمند در موش

Advances in molecular manipulation of mammalian genes have permitted precise replacement of a known normal gene with a mutant version. The process of gen- erating a strain of mutant mice involves two separate manipulations. A gene on a chromosome is replaced by homologous recombination in a special cell line known as embryonic stem cells, and the modified cell line is incorporated into the germ cell population of the embryo (Figure 2-7).

پیشرفت‌ها در دستکاری مولکولی ژن‌های پستانداران، جایگزینی دقیق یک ژن طبیعی شناخته شده با یک نسخه جهش یافته را مجاز کرده است. فرآیند تولید سویه ای از موش‌های جهش یافته شامل دو دستکاری جداگانه است. یک ژن روی کروموزوم با نوترکیبی همولوگ در یک رده سلولی خاص به نام سلول‌های بنیادی جنینی جایگزین می‌شود و رده سلولی اصلاح شده در جمعیت سلول‌های زایای جنین گنجانده می‌شود (شکل 2-7).

The gene of interest must first be cloned. The gene is mutated, and a selectable marker, usually a drug- resistance gene, is then introduced into the mutated fragment. The altered gene is then introduced into embryonic stem cells, and clones of cells that incorpo- rate the altered gene are isolated. DNA samples of each clone are tested to identify a clone in which the mutated gene has been integrated into the homologous (normal) site, rather than some other random site.

ابتدا باید ژن مورد نظر شبیه سازی شود. ژن جهش یافته است، و سپس یک نشانگر قابل انتخاب، که معمولاً یک ژن مقاومت دارویی است، به قطعه جهش یافته وارد می‌شود. سپس ژن تغییر یافته به سلول‌های بنیادی جنینی وارد می‌شود و کلون‌هایی از سلول‌هایی که ژن تغییر یافته را ترکیب می‌کنند، جدا می‌شوند. نمونه‌های DNA هر کلون برای شناسایی کلونی که در آن ژن جهش‌یافته در سایت همولوگ (طبیعی) ادغام شده است، به جای سایت تصادفی دیگر، آزمایش می‌شوند.

When a suitable clone has been identified, the cells are injected into a mouse embryo at the blastocyst stage (3 to 4 days after fertilization), when the embryo consists of approximately 100 cells. These embryos are then reintroduced into a female that has been hormonally prepared for implantation and allowed to come to term. The resulting embryos are chimeric mixtures between the stem cell line and the host embryo.

هنگامی‌که یک کلون مناسب شناسایی شد، سلول‌ها در مرحله بلاستوسیست (3 تا 4 روز پس از لقاح) به جنین موش تزریق می‌شوند، زمانی که جنین از حدود 100 سلول تشکیل شده است. این جنین‌ها سپس به ماده‌ای که از نظر هورمونی برای لانه‌گزینی آماده شده و اجازه داده می‌شود که به پایان برسد، وارد می‌شوند. جنین‌های حاصل مخلوط‌های کایمریک بین رده سلول‌های بنیادی و جنین میزبان هستند.

Embryonic stem cells in the mouse have the capability of participating in all aspects of development, including the germline. The injected cells can become germ cells and pass on the altered gene to future generations of mice. This technique has been used to generate mutations in various genes crucial to development or function in the nervous system.

سلول‌های بنیادی جنینی در موش توانایی مشارکت در همه جنبه‌های رشد، از جمله مولد را دارند. سلول‌های تزریق شده می‌توانند به سلول‌های زایا تبدیل شوند و ژن تغییر یافته را به نسل‌های آینده موش‌ها منتقل کنند. این تکنیک برای ایجاد جهش در ژن‌های مختلف حیاتی برای رشد یا عملکرد سیستم عصبی استفاده شده است.

Restricting Gene Knockout and Regulating Transgenic Expression

محدود کردن ناک اوت ژن و تنظیم بیان تراریخته

To improve the utility of gene knockout technology, methods have been developed that restrict deletions to cells in a specific tissue or at specific points in an animal’s development. One method of regional restriction exploits the Cre/loxP system. The Cre/loxP system is a site- specific recombination system, derived from the P1 phage, in which the phage enzyme Cre recombinase catalyzes recombination between 34 bp loxP recognition sequences, which are normally not present in animal genomes.

برای بهبود کاربرد فناوری حذف ژن، روش‌هایی توسعه یافته‌اند که حذف را به سلول‌های یک بافت خاص یا در نقاط خاصی از رشد حیوان محدود می‌کند. یکی از روش‌های محدودیت منطقه ای از سیستم Cre/loxP استفاده می‌کند. سیستم Cre/loxP یک سیستم نوترکیبی خاص مکان است که از فاژ P1 مشتق شده است، که در آن آنزیم فاژی Cre recombinase، نوترکیبی بین توالی‌های شناسایی 34 جفت باز loxP را کاتالیز می‌کند، که معمولاً در ژنوم حیوانات وجود ندارد.

The loxP sequences can be inserted into the genome of embryonic stem cells by homologous recombination such that they flank one or more exons of a gene of interest (called a floxed gene). When the stem cells are injected into an embryo, one can eventually breed a mouse in which the gene of interest is floxed and still functional in all cells of the animal.

توالی‌های loxP را می‌توان با نوترکیبی همولوگ به ژنوم سلول‌های بنیادی جنینی وارد کرد، به طوری که یک یا چند اگزون از یک ژن مورد نظر (به نام ژن floxed) کنار هم قرار گیرند. وقتی سلول‌های بنیادی به جنین تزریق می‌شوند، در نهایت می‌توان موشی را پرورش داد که در آن ژن مورد نظر در تمام سلول‌های حیوان فعال است.

A second line of transgenic mice can then be generated that expresses Cre recombinase under the control of a neural promoter sequence that is normally expressed in a restricted brain region. By crossing the Cre trans- genic line of mice with the line of mice with the floxed gene of interest, the gene will only be deleted in those cells that express the Cre transgene.

سپس می‌توان خط دومی‌از موش‌های تراریخته تولید کرد که Cre recombinase را تحت کنترل یک توالی پروموتر عصبی که معمولاً در یک ناحیه محدود مغز بیان می‌شود، بیان می‌کند. با تلاقی خط تراریخته Cre از موش‌ها با خط موش‌هایی با ژن مورد علاقه، ژن فقط در سلول‌هایی حذف می‌شود که تراریخته Cre را بیان می‌کنند.

In the example shown in Figure 2-8A, the gene encoding the NR1 (or GluN1) subunit of the N-methyl- D-aspartate (NMDA) glutamate receptor has been flanked with loxP elements and then crossed with a mouse line expressing Cre recombinase under control of the CaMKII promoter, which normally is expressed in forebrain neurons. In this particular line, expression was fortuitously limited to the CA1 region of the hippocampus, resulting in selective deletion of the NR1 subunit in this brain region (Figure 2-8B). Because the CaMKII promoter only activates gene transcription postnatally, early develop- mental changes are minimized by this strategy.

در مثال نشان داده شده در شکل 2-8A، ژن کد کننده زیرواحد NR1 (یا GluN1) گیرنده گلوتامات N-متیل-D-آسپارتات (NMDA) با عناصر loxP کنار گذاشته شده و سپس با خط موشی که Cre recombinase را بیان می‌کند تلاقی داده شده است. تحت کنترل پروموتر CaMKII، که به طور معمول در نورون‌های جلو مغز بیان می‌شود. در این خط خاص، بیان به طور تصادفی به ناحیه CA1 هیپوکامپ محدود شد و منجر به حذف انتخابی زیر واحد NR1 در این ناحیه مغز شد (شکل 2-8B). از آنجا که پروموتر CaMKII تنها رونویسی ژن را پس از تولد فعال می‌کند، تغییرات اولیه رشد با این استراتژی به حداقل می‌رسد.

In addition to regional restriction of gene expression, control over the timing of gene expression gives the investigator an additional degree of flexibility and can exclude the possibility that any abnormality observed in the phenotype of the mature animal is the result of a developmental defect produced by the transgene. This can be done in mice by constructing a gene that can be turned on or off with a drug.

علاوه بر محدودیت منطقه‌ای بیان ژن، کنترل بر زمان‌بندی بیان ژن به محقق درجه انعطاف بیشتری می‌دهد و می‌تواند این احتمال را که هر گونه ناهنجاری مشاهده شده در فنوتیپ حیوان بالغ در نتیجه نقص رشدی ایجاد شده توسط تراریخته این کار را می‌توان در موش‌ها با ساخت ژنی انجام داد که می‌تواند با دارو روشن یا خاموش شود.

One starts by creating two lines of mice. Line 1 carries a particular transgene that is under control of the promoter teto, which is ordinarily found only in bacteria. This promoter cannot by itself turn on the gene; it needs to be activated by a specific transcriptional regulator. Thus the second line of mice expresses a second transgene that encodes a hybrid transcription factor, the tetracycline transactivator (tTA), which recognizes and binds to the teto promoter. Expression of tTA can be placed under the control of a promoter in the mouse genome that normally drives gene transcription in only specific classes of neurons or specific brain regions.

یکی با ایجاد دو خط موش شروع می‌کند. خط 1 حامل یک ژن خاص است که تحت کنترل پروموتر تتو است که معمولاً فقط در باکتری‌ها یافت می‌شود. این پروموتر به خودی خود نمی‌تواند ژن را روشن کند. باید توسط یک تنظیم کننده رونویسی خاص فعال شود. بنابراین خط دوم موش‌ها ژن دومی‌را بیان می‌کنند که یک فاکتور رونویسی ترکیبی، فعال کننده تتراسایکلین (tTA) را رمزگذاری می‌کند، که پروموتر تتو را شناسایی کرده و به آن متصل می‌شود. بیان tTA را می‌توان تحت کنترل یک پروموتر در ژنوم موش قرار داد که معمولاً رونویسی ژن را فقط در کلاس‌های خاصی از نورون‌ها یا مناطق خاص مغز هدایت می‌کند.

Box 2-2 Generating Mutations in Experimental Animals (continued)

کادر 2-2 ایجاد جهش در حیوانات آزمایشی (ادامه)

Figure 2-7 Creating mutant mice strains. (Adapted from Alberts et al. 2002.)

A. Creating mouse stem cells with specific targeted mutations.

B. Using altered embryonic stem (ES) cells to create genetically modified mice.

شکل 2-7 ایجاد سویه‌های موش جهش یافته. (برگرفته از آلبرتز و همکاران 2002.)
الف. ایجاد سلول‌های بنیادی موش با جهش‌های هدفمند خاص.
ب. استفاده از سلول‌های بنیادی جنینی (ES) تغییر یافته برای ایجاد موش‌های اصلاح شده ژنتیکی.

When the two lines of mice are mated, some of the offspring will carry both transgenes. In these mice, the tTA binds to the teto promoter and activates the down- stream transgene. What makes the tTA transcription factor particularly useful is that it becomes inactivated when it binds certain antibiotics, such as tetracycline, allowing transgene expression to be regulated by administering antibiotics to mice. One can also generate mice that express a mutant form of tTA called reverse tTA (rtTA). This transactivator will not bind to teto unless the animal is fed doxycycline. In this case, the transgene is always turned off unless the drug is given (Figure 2-9).

هنگامی‌که دو خط موش جفت می‌شوند، برخی از فرزندان حامل هر دو تراریخته خواهند بود. در این موش‌ها، tTA به پروموتر تتو متصل می‌شود و ژن پایین‌دستی را فعال می‌کند. چیزی که فاکتور رونویسی tTA را به ویژه مفید می‌کند این است که با اتصال آنتی بیوتیک‌های خاصی مانند تتراسایکلین غیرفعال می‌شود و به موش اجازه می‌دهد بیان تراریخته را با تجویز آنتی بیوتیک‌ها تنظیم کند. همچنین می‌توان موش‌هایی تولید کرد که نوعی جهش یافته از tTA به نام tTA معکوس (rtTA) را بیان می‌کنند. این ترانس فعال کننده به تتو متصل نمی‌شود مگر اینکه حیوان به داکسی سایکلین تغذیه شود. در این حالت تراریخته همیشه خاموش می‌شود مگر اینکه دارو داده شود (شکل 2-9).

Altering Gene Function by RNA Interference and CRISPR

تغییر عملکرد ژن توسط تداخل RNA و CRISPR

Finally, genes can be inactivated by targeting them with modern molecular tools. One such method is RNA interference, which takes advantage of the fact that most double-stranded RNAs in eukaryotic cells are routinely destroyed; the whole RNA is destroyed even if only part of it is double-stranded. By introducing a short RNA sequence that artificially causes a selected mRNA to become double-stranded, researchers can activate this process to reduce the mRNA levels for specific genes.

در نهایت، ژن‌ها را می‌توان با هدف قرار دادن آنها با ابزارهای مولکولی مدرن غیر فعال کرد. یکی از این روش‌ها تداخل RNA است که از این واقعیت بهره می‌برد که اکثر RNA‌های دو رشته‌ای در سلول‌های یوکاریوتی به طور معمول از بین می‌روند. کل RNA از بین می‌رود حتی اگر فقط بخشی از آن دو رشته ای باشد. با معرفی یک توالی RNA کوتاه که به طور مصنوعی باعث می‌شود یک mRNA انتخابی دو رشته ای شود، محققان می‌توانند این فرآیند را برای کاهش سطوح mRNA برای ژن‌های خاص فعال کنند.

Another experimental tool is CRISPR, a method in which components of a bacterial immune system are deployed in nonbacterial cells to directly attack a selected DNA sequence. To target a gene with CRISPR, a bacterial protein (typically but not always a protein called CAS9) is produced together with an engineered guide RNA that has sequence similarity with the target gene. The CAS9-guide RNA complex seeks out and cleaves the target sequence in the genome of the cell of interest. That initial cleavage can induce point mutations, insertions, and deletions at that site, and can also facilitate desired recombination or genetic replacement events. CRISPR tools are increasing in their sophistication and precision to the extent that they are now being considered for repair of hereditary mutations in people with severe inherited genetic diseases.

ابزار آزمایشی دیگر CRISPR است، روشی که در آن اجزای سیستم ایمنی باکتریایی در سلول‌های غیر باکتریایی مستقر می‌شوند تا مستقیماً به یک توالی DNA انتخاب شده حمله کنند. برای هدف قرار دادن یک ژن با CRISPR، یک پروتئین باکتریایی (معمولاً اما نه همیشه پروتئینی به نام CAS9) همراه با یک RNA راهنمای مهندسی شده تولید می‌شود که توالی مشابهی با ژن هدف دارد. مجموعه RNA راهنمای CAS9 دنباله هدف را در ژنوم سلول مورد نظر جستجو می‌کند و می‌شکافد. این برش اولیه می‌تواند جهش‌های نقطه‌ای، درج‌ها و حذف‌ها را در آن محل ایجاد کند و همچنین می‌تواند نوترکیبی مورد نظر یا رویدادهای جایگزین ژنتیکی را تسهیل کند. ابزارهای CRISPR در پیچیدگی و دقت خود در حال افزایش هستند تا جایی که اکنون برای ترمیم جهش‌های ارثی در افراد مبتلا به بیماری‌های ژنتیکی شدید ارثی مورد توجه قرار گرفته اند.

Figure 2-8 The Cre/loxP system for gene knockout in selective regions.

A. A line of mice is bred in which the gene encoding the NR1 subunit of the NMDA receptor has been flanked by loxP genetic elements (transgenic mouse line 1). These so-called “floxed NR1” mice are then crossed with a second line of mice in which a transgene coding for Cre recombinase is placed under the control of a transcriptional promoter specific to a cell type or a tissue type (transgenic mouse line 2). In this example, the promoter from the CaMKIIa gene is used to drive expression of the Cre gene. In progeny that are homozygous for the floxed gene and that carry the Cre recombinase transgene, the floxed gene will be deleted by Cremediated loxP recombination only in cell type(s) in which the promoter driving Cre expression is active.

B. In situ hybridization is used to detect mRNA for the NR1 subunit in hippocampal slices from wild-type and mutant mice that contain two floxed NR1 alleles and express Cre recombinase under the control of the CaMKII promoter. In the mutant mice, expression of the mRNA for NR1 (dark staining) is greatly reduced in the CA1 region of the hippocampus but remains normal in CA3 and the dentate gyrus (DG). (Reproduced, with permission, from Tsien, Huerta, and Tonegawa 1996.)

شکل 2-8 سیستم Cre/loxP برای حذف ژن در مناطق انتخابی.
الف. یک سری از موش‌ها پرورش داده می‌شوند که در آن ژن کد کننده زیر واحد NR1 گیرنده NMDA توسط عناصر ژنتیکی loxP (خط 1 موش تراریخته) احاطه شده است. این موش‌های موسوم به NR1 با خط دوم موش تلاقی داده می‌شوند که در آن یک ترانس ژن کدکننده Cre recombinase تحت کنترل یک پروموتر رونویسی خاص برای یک نوع سلول یا یک نوع بافت قرار می‌گیرد (موش تراریخته خط 2). در این مثال، پروموتر از ژن CaMKIIa برای هدایت بیان ژن Cre استفاده می‌شود. در فرزندانی که هموزیگوت برای ژن floxed هستند و حامل ترانس ژن Cre recombinase هستند، ژن floxed با نوترکیبی Cremediated loxP فقط در نوع سلولی که در آن‌ها پروموتر محرک بیان Cre فعال است حذف می‌شود.

ب. هیبریداسیون درجا برای شناسایی mRNA زیر واحد NR1 در برش‌های هیپوکامپ از موش‌های نوع وحشی و جهش یافته که حاوی دو آلل NR1 فلوکس شده و بیان Cre recombinase تحت کنترل پروموتر CaMKII هستند، استفاده می‌شود. در موش‌های جهش یافته، بیان mRNA برای NR1 (رنگ‌آمیزی تیره) در ناحیه CA1 هیپوکامپ بسیار کاهش می‌یابد، اما در CA3 و شکنج دندانه‌دار (DG) طبیعی باقی می‌ماند. (تکثیر شده، با اجازه، از Tsien، Huerta، و Tonegawa 1996.)

Box 2-2 Generating Mutations in Experimental Animals (continued)

کادر 2-2 ایجاد جهش در حیوانات آزمایشی (ادامه)

RNA interference and CRISPR have great potential to increase the power of genetic analysis because they can be used on any species in which DNA or RNA can be delivered to cells, including animals that are not now used in classical genetic analysis, such as long-lived birds, fish, and even primates.

تداخل RNA و CRISPR پتانسیل بالایی برای افزایش قدرت تجزیه و تحلیل ژنتیکی دارند، زیرا می‌توانند روی هر گونه‌ای که در آن DNA یا RNA می‌تواند به سلول‌ها تحویل داده شود، از جمله حیواناتی که اکنون در آنالیز ژنتیکی کلاسیک استفاده نمی‌شوند، مانند حیواناتی که عمر طولانی دارند، استفاده کرد. پرندگان، ماهی‌ها و حتی نخستی‌ها.

Figure 2-9 The tetracycline system for temporal and spatial regulation of transgene expression. Two independent lines of transgenic mice are bred. One line expresses, under the control of the CaMKIla promoter, the tetracycline transactivator (tTA), an engineered protein incorporating a bacterial transcription factor that recognizes the bacterial teto operon. The second line contains a transgene of interest-here encoding a constitutively active form of CaMKII (CaMKII-Asp286) that makes the kinase persistently active in the absence of Ca2+ -whose expression is under control of teto. When these two lines are mated, the offspring express the tTA protein in a pattern restricted to the forebrain. When the tTA protein binds to teto, it will activate transcription of the downstream gene of interest. Tetracycline (or doxycycline) given to the offspring binds to the tTA protein and causes a conformational change that leads to the unbinding of the protein from teto, blocking transgene expression. In this manner, mice will express CaMKII-Asp286 in the forebrain, and this expression can be turned off by administering doxycycline to the mice. (Reproduced, with permission, from Mayford et al. 1996.)

شکل 2-9 سیستم تتراسایکلین برای تنظیم زمانی و مکانی بیان تراریخته. دو لاین مستقل از موش‌های تراریخته پرورش داده می‌شوند. یک خط، تحت کنترل پروموتر CaMKIla، ترانس فعال کننده تتراسایکلین (tTA)، یک پروتئین مهندسی شده حاوی یک فاکتور رونویسی باکتریایی است که اپرون تتو باکتریایی را شناسایی می‌کند. خط دوم شامل یک تراریخته مورد علاقه است که در اینجا یک فرم فعال اصلی CaMKII (CaMKII-Asp286) را کد می‌کند که باعث می‌شود کیناز در غیاب Ca2+ -که بیان آن تحت کنترل تتو است به طور مداوم فعال شود. هنگامی‌که این دو خط جفت می‌شوند، فرزندان پروتئین tTA را در یک الگوی محدود به مغز جلویی بیان می‌کنند. هنگامی‌که پروتئین tTA به تتو متصل می‌شود، رونویسی ژن پایین دستی مورد نظر را فعال می‌کند. تتراسایکلین (یا داکسی سایکلین) که به فرزندان داده می‌شود به پروتئین tTA متصل می‌شود و باعث تغییر ساختاری می‌شود که منجر به جدا شدن پروتئین از تتو می‌شود و بیان تراریخته را مسدود می‌کند. به این ترتیب، موش‌ها CaMKII-Asp286 را در جلو مغز بیان می‌کنند و این بیان را می‌توان با تجویز داکسی سایکلین به موش‌ها خاموش کرد. (تکثیر شده، با اجازه، از Mayford و همکاران 1996.)

Box 2-3 Introducing Transgenes in Flies and Mice

کادر 2-3 معرفی تراریخته‌ها در مگس‌ها و موش‌ها

Genes can be experimentally introduced in mice by injecting DNA into the nucleus of newly fertilized eggs (Figure 2-10). In some of the injected eggs, the new gene, or transgene, is incorporated into a random site on one of the chromosomes. Because the embryo is at the one- cell stage, the incorporated gene is replicated and ends up in all (or nearly all) of the animal’s cells, including the germline.

ژن‌ها را می‌توان با تزریق DNA به هسته تخم‌های تازه بارور شده در موش‌ها به صورت تجربی معرفی کرد (شکل 2-10). در برخی از تخمک‌های تزریق شده، ژن جدید یا ترانس ژن در یک مکان تصادفی در یکی از کروموزوم‌ها گنجانده می‌شود. از آنجایی که جنین در مرحله تک سلولی است، ژن گنجانده شده تکثیر می‌شود و در تمام (یا تقریباً همه) سلول‌های حیوان، از جمله زایا، ختم می‌شود.

Gene incorporation is illustrated with a coat color marker gene rescued by injecting a gene for pigment production into an egg obtained from an albino strain. Mice with patches of pigmented fur indicate successful expression of DNA. The transgene’s presence is confirmed by testing a sample of DNA from the injected animals.

ادغام ژن با یک ژن نشانگر رنگ پوشش که با تزریق یک ژن برای تولید رنگدانه به تخم مرغ به دست آمده از سویه آلبینو نجات یافته است، نشان داده شده است. موش هایی با تکه های خز رنگدانه بیانگر موفقیت آمیز DNA هستند. وجود تراریخته با آزمایش نمونه ای از DNA از حیوانات تزریق شده تایید می شود.

A similar approach is used in flies. The DNA to be injected is cloned into a transposable element (P element). When injected into the embryo, the DNA becomes inserted into the DNA of germ cell nuclei. P elements can be engineered to express genes at specific times and in specific cells. Transgenes may be wild-type genes that restore function to a mutant or designer genes that alter the expression of other genes or code for a specifically altered protein.

رویکرد مشابهی در مگس‌ها استفاده می‌شود. DNA مورد تزریق در یک عنصر قابل انتقال (عنصر P) کلون می‌شود. هنگامی‌که DNA به جنین تزریق می‌شود، به DNA هسته سلول‌های زایا وارد می‌شود. عناصر P را می‌توان برای بیان ژن‌ها در زمان‌های خاص و در سلول‌های خاص مهندسی کرد. تراریخته‌ها ممکن است ژن‌هایی از نوع وحشی باشند که عملکرد را به ژن‌های جهش‌یافته یا طراح که بیان ژن‌های دیگر را تغییر می‌دهند یا کد یک پروتئین خاص تغییریافته را تغییر می‌دهند، باز می‌گردانند.

Figure 2-10 Generating transgenic mice and flies. Here the gene injected into the mouse causes a change in coat color, while the gene injected into the fly causes a change in eye color. In some transgenic animals of both species, the DNA is inserted at different chromosomal sites in different cells (see illustration at bottom). (Adapted from Alberts et al. 2002.)

شکل 2-10 تولید موش و مگس تراریخته. در اینجا ژن تزریق شده به موش باعث تغییر رنگ پوشش می‌شود، در حالی که ژن تزریق شده به مگس باعث تغییر رنگ چشم می‌شود. در برخی از حیوانات تراریخته هر دو گونه، DNA در مکان‌های کروموزومی‌مختلف در سلول‌های مختلف وارد می‌شود (به شکل پایین مراجعه کنید). (برگرفته از آلبرتز و همکاران 2002.)

We have a particularly complete picture of the genetic basis of the circadian control of behavior. An animal’s circadian rhythm couples certain behaviors to a 24-hour cycle linked to the rising and setting of the sun. The core of circadian regulation is an intrinsic biological clock that oscillates over a 24-hour cycle. Because of the intrinsic periodicity of the clock, circadian behavior persists even in the absence of light or other environmental influences.

ما تصویر کاملی از اساس ژنتیکی کنترل شبانه روزی رفتار داریم. ریتم شبانه روزی یک حیوان رفتارهای خاصی را با یک چرخه 24 ساعته مرتبط با طلوع و غروب خورشید پیوند می‌دهد. هسته تنظیم شبانه روزی یک ساعت بیولوژیکی ذاتی است که در یک چرخه 24 ساعته نوسان می‌کند. به دلیل تناوب ذاتی ساعت، رفتار شبانه روزی حتی در غیاب نور یا سایر تأثیرات محیطی ادامه دارد.

The circadian clock can be reset, such that changes in the day-night cycle eventually result in a matching shift in the intrinsic oscillator, a phenomenon familiar to any traveler recovering from jet lag. The clock is reset by light-driven signals transmitted by the eye to the brain. Finally, the clock drives effector pathways for specific behaviors, such as sleep and locomotion.

ساعت شبانه روزی را می‌توان بازنشانی کرد، به طوری که تغییرات در چرخه روز و شب در نهایت منجر به تغییر مشابه در نوسانگر ذاتی می‌شود، پدیده ای که برای هر مسافری که از جت لگ بهبود می‌یابد آشنا است. ساعت توسط سیگنال‌های نور محور که توسط چشم به مغز ارسال می‌شود، تنظیم مجدد می‌شود. در نهایت، ساعت مسیرهای اثرگذار را برای رفتارهای خاص، مانند خواب و حرکت، هدایت می‌کند.

Benzer’s group searched through thousands of mutant flies to look for rare flies that failed to follow circadian rhythms because of mutations in the genes that direct circadian oscillation. From this work emerged the first insight into the molecular machinery of the circadian clock. Mutations in the period, or per, gene affected all circadian behaviors generated by the fly’s internal clock.

گروه بنزر در میان هزاران مگس جهش یافته جست و جو کردند تا به دنبال مگس‌های نادری بگردند که به دلیل جهش در ژن‌هایی که نوسانات شبانه روزی را هدایت می‌کنند، از ریتم شبانه روزی پیروی نمی‌کردند. از این کار اولین بینش در مورد ماشین آلات مولکولی ساعت شبانه روزی پدیدار شد. جهش در این دوره یا هر ژن بر تمام رفتارهای شبانه روزی ایجاد شده توسط ساعت داخلی مگس تأثیر می‌گذارد.

Interestingly, per mutations could change the circadian clock in several ways (Figure 2-11). Arrhythmic per mutant flies, which exhibited no discernible intrinsic rhythms in any behavior, lacked all function of the per gene, so per is essential for rhythmic behavior. Per mutations that maintained some function of the gene resulted in abnormal rhythms. Long-day alleles produced 28-hour behavioral cycles, whereas short-day alleles produced a 19-hour cycle. Thus per is not just an essential piece of the clock, it is actually a timekeeper whose activity can change the rate at which the clock runs.

جالب توجه است، هر جهش می‌تواند ساعت شبانه روزی را به روش‌های مختلفی تغییر دهد (شکل 2-11). آریتمی‌هر مگس جهش یافته، که هیچ ریتم ذاتی قابل تشخیصی را در هیچ رفتاری از خود نشان نداد، فاقد تمام عملکرد هر ژن بود، بنابراین per برای رفتار ریتمیک ضروری است. هر جهش که برخی از عملکرد ژن را حفظ می‌کرد منجر به ریتم‌های غیر طبیعی می‌شود. آلل‌های روز بلند چرخه رفتاری 28 ساعته تولید می‌کنند، در حالی که آلل‌های روز کوتاه یک چرخه 19 ساعته تولید می‌کنند. بنابراین per تنها یک قطعه ضروری از ساعت نیست، بلکه در واقع یک زمان‌سنج است که فعالیت آن می‌تواند سرعت کارکرد ساعت را تغییر دهد.

The per mutant has no major adverse effects other than the change in circadian behavior. This observation is important because prior to the discovery of per many had questioned whether there could be true “behavior genes” that were not required for the physiological needs of an animal. Per does seem to be such a “behavior gene.”

هر جهش یافته به جز تغییر در رفتار شبانه روزی، هیچ اثر جانبی عمده ای ندارد. این مشاهدات مهم است زیرا قبل از کشف برای بسیاری از افراد سوال می‌کردند که آیا می‌تواند “ژن‌های رفتاری” واقعی وجود داشته باشد که برای نیازهای فیزیولوژیکی یک حیوان مورد نیاز نباشد. به نظر می‌رسد Per چنین “ژن رفتاری” باشد.

How does per keep time? The protein product PER is a transcriptional regulator that affects the expression of other genes. Levels of PER are regulated throughout the day. Early in the morning, PER and its mRNA are low. Over the course of the day, the PER mRNA and protein accumulate, reaching peak levels after dusk and during the night. The levels then decrease, falling before the next dawn. These observations provide an answer to the circadian rhythm puzzle-a central regulator appears and disappears throughout the day. But they are also unsatisfying because they only push the question back one step-what makes PER cycle? The answer to this question required the discovery of additional clock genes, which were discovered in flies and also in mice.

هر زمان نگه داشتن چگونه است؟ محصول پروتئینی PER یک تنظیم کننده رونویسی است که بر بیان ژن‌های دیگر تأثیر می‌گذارد. سطوح PER در طول روز تنظیم می‌شود. در اوایل صبح، PER و mRNA آن کم است. در طول روز، PER mRNA و پروتئین جمع می‌شوند و پس از غروب و در طول شب به اوج خود می‌رسند. سطوح سپس کاهش می‌یابد، قبل از طلوع بعد کاهش می‌یابد. این مشاهدات پاسخی به پازل ریتم شبانه روزی می‌دهد – یک تنظیم کننده مرکزی در طول روز ظاهر می‌شود و ناپدید می‌شود. اما آنها همچنین رضایت بخش نیستند زیرا آنها فقط این سؤال را یک قدم به عقب می‌رانند – چه چیزی باعث چرخه PER می‌شود؟ پاسخ به این سوال مستلزم کشف ژن‌های ساعت اضافی بود که در مگس‌ها و همچنین در موش‌ها کشف شد.

Emboldened by the success of the fly circadian rhythm screens, Joseph Takahashi began similar but far more labor-intensive genetic screens in mice in the 1990s. He screened hundreds of mutant mice for the rare individuals with alterations in their circadian locomotion period and found a single gene mutation that he called clock. When mice homozygous for the clock mutation are transferred to darkness, they initially experience extremely long circadian periods and later a complete loss of circadian rhythmicity (Figure 2-12). The clock gene therefore appears to regulate two fundamental properties of the circadian rhythm: the length of the circadian period and the persistence of rhythmicity in the absence of sensory input. These properties are conceptually identical to the properties of the per gene in flies.

جوزف تاکاهاشی که از موفقیت نمایش‌های ریتم شبانه‌روزی مگس جسارت یافته بود، در دهه 1990، نمایش‌های ژنتیکی مشابه اما بسیار کار بر روی موش‌ها را آغاز کرد. او صدها موش جهش یافته را برای افراد نادر با تغییرات در دوره حرکت شبانه روزی آنها غربال کرد و یک جهش ژنی را پیدا کرد که آن را ساعت نامید. هنگامی‌که موش‌های هموزیگوت برای جهش ساعت به تاریکی منتقل می‌شوند، در ابتدا دوره‌های شبانه روزی بسیار طولانی و بعداً از دست دادن کامل ریتمیک شبانه روزی را تجربه می‌کنند (شکل 2-12). بنابراین به نظر می‌رسد که ژن ساعت دو ویژگی اساسی ریتم شبانه روزی را تنظیم می‌کند: طول دوره شبانه روزی و تداوم ریتمیک بودن در غیاب ورودی حسی. این ویژگی‌ها از نظر مفهومی‌با ویژگی‌های هر ژن در مگس‌ها یکسان است.

The mouse clock gene, like the per gene in flies, encodes a transcriptional regulator whose activity oscillates through the day. The mouse CLOCK and fly PER proteins also shared a domain called a PAS domain, characteristic of a subset of transcriptional regulators. This observation suggests that the same molecular mechanism-oscillation of PAS-domain transcriptional regulation-controls circadian rhythm in flies and mice.

ژن ساعت موش، مانند ژن per در مگس‌ها، یک تنظیم کننده رونویسی را رمزگذاری می‌کند که فعالیت آن در طول روز نوسان می‌کند. پروتئین‌های CLOCK و fly PER ماوس نیز دامنه‌ای به نام دامنه PAS دارند که مشخصه زیر مجموعه‌ای از تنظیم‌کننده‌های رونویسی است. این مشاهدات نشان می‌دهد که همان مکانیسم مولکولی – نوسان مقررات رونویسی دامنه PAS – ریتم شبانه‌روزی را در مگس‌ها و موش‌ها کنترل می‌کند.

More significantly, parallel studies of flies and mice showed that similar groups of transcriptional regulators affect the circadian clock in both animals. After the mouse clock gene was cloned, a fly circadian rhythm gene was cloned and found to be even more closely related to mouse clock, than was per. In a different study, a mouse gene similar to fly per was identified and inactivated by reverse genetics. The mutant mouse had a circadian rhythm defect, like fly per mutants. In other words, both flies and mice use both clock and per genes to control their circadian rhythms. A group of genes, not one gene, are conserved regulators of the circadian clock.

به طور قابل توجهی، مطالعات موازی روی مگس‌ها و موش‌ها نشان داد که گروه‌های مشابهی از تنظیم کننده‌های رونویسی بر ساعت شبانه روزی در هر دو حیوان تأثیر می‌گذارند. پس از کلون‌سازی ژن ساعت موش، یک ژن با ریتم شبانه‌روزی مگس شبیه‌سازی شد و مشخص شد که حتی بیشتر از آنچه بود، با ساعت موش مرتبط است. در یک مطالعه متفاوت، یک ژن موش شبیه به fly per توسط ژنتیک معکوس شناسایی و غیرفعال شد. موش جهش یافته دارای نقص ریتم شبانه روزی بود، مانند پرواز در هر جهش. به عبارت دیگر، هم مگس‌ها و هم موش‌ها از هر دو ژن ساعت و پر برای کنترل ریتم شبانه روزی خود استفاده می‌کنند. گروهی از ژن‌ها، نه یک ژن، تنظیم کننده‌های حفظ شده ساعت شبانه روزی هستند.

Characterization of these genes has led to an understanding of the molecular mechanisms of circadian rhythm and a dramatic demonstration of the similarity of these mechanisms in flies and mice. In both flies and mice, the CLOCK protein is a transcriptional activator. Together with a partner protein, it controls the transcription of genes that determine behaviors such as locomotor activity levels. CLOCK and its partner also stimulate the transcription of the per gene. However, PER protein represses CLOCK’s ability to stimulate per gene expression, so as PER proteinaccumulates, per transcription falls (Figure 2-13). The 24-hour cycle comes about because the accumulation and activation of PER protein is delayed by many hours after the transcription of per, a result of PER phosphorylation, PER instability, and interactions with other cycling proteins.

خصوصیات این ژن‌ها به درک مکانیسم‌های مولکولی ریتم شبانه روزی و نمایش چشمگیر شباهت این مکانیسم‌ها در مگس‌ها و موش‌ها منجر شده است. هم در مگس‌ها و هم در موش‌ها، پروتئین CLOCK یک فعال کننده رونویسی است. همراه با پروتئین شریک، رونویسی ژن‌هایی را که رفتارهایی مانند سطح فعالیت حرکتی را تعیین می‌کنند، کنترل می‌کند. CLOCK و شریک آن نیز رونویسی هر ژن را تحریک می‌کنند. با این حال، پروتئین PER توانایی CLOCK برای تحریک بیان هر ژن را سرکوب می‌کند، بنابراین با تجمع پروتئین PER، هر رونویسی کاهش می‌یابد (شکل 2-13). چرخه 24 ساعته به این دلیل اتفاق می‌افتد که تجمع و فعال‌سازی پروتئین PER ساعت‌ها پس از رونویسی per به تأخیر می‌افتد که نتیجه آن فسفوریلاسیون PER، ناپایداری PER و برهمکنش با سایر پروتئین‌های چرخه‌ای است.

Figure 2-11 A single gene governs the circadian rhythms of behaviors in Drosophila. Mutations in the period, or per, gene affect all circadian behaviors regulated by the fly’s internal clock. (Reproduced, with permission, from Konopka and Benzer 1971.)

A. Locomotor rhythms in normal Drosophila and three strains of per mutants: short-day, long-day, and arrhythmic. Flies were shifted from a cycle of 12 hours of light and 12 hours of dark into continuous darkness, under infrared light. Thick segments in the record indicate activity.

B. Normal adult fly populations emerge from their pupal cases in cyclic fashion, even in constant darkness. The plots show the number of flies (in each of four populations) emerging per hour over a 4-day period of constant darkness. The arrhythmic mutant population emerges without any discernible rhythm.

شکل 2-11 یک ژن منفرد بر ریتم شبانه روزی رفتارها در مگس سرکه حاکم است. جهش در دوره یا هر ژن بر تمام رفتارهای شبانه روزی تنظیم شده توسط ساعت داخلی مگس تأثیر می‌گذارد. (تکثیر شده، با اجازه، از Konopka و Benzer 1971.)

الف. ریتم‌های حرکتی در مگس سرکه طبیعی و سه سویه از هر جهش یافته: روز کوتاه، طولانی روز و آریتمی. مگس‌ها از یک چرخه 12 ساعته نور و 12 ساعت تاریکی به تاریکی پیوسته، تحت نور مادون قرمز منتقل شدند. بخش‌های ضخیم در رکورد نشان دهنده فعالیت است.

ب- جمعیت مگس‌های بالغ طبیعی به شکل چرخه ای، حتی در تاریکی دائمی، از موارد شفیرگی خود خارج می‌شوند. نمودارها تعداد مگس‌ها (در هر چهار جمعیت) را نشان می‌دهد که در هر ساعت در یک دوره 4 روزه تاریکی ثابت ظاهر می‌شوند. جمعیت جهش یافته آریتمی‌بدون هیچ ریتم قابل تشخیصی ظاهر می‌شود.

The molecular properties of per, clock, and related genes generate all properties essential for circadian rhythm.

ویژگی‌های مولکولی ژن‌های per، clock و مربوط به آن، همه ویژگی‌های ضروری برای ریتم شبانه‌روزی را ایجاد می‌کنند.

Figure 2-12 Circadian rhythm regulation by the clock gene in mice. The records show periods of locomotor activity by three animals: wild-type, heterozygous, and homozygous. All animals were kept on a light-dark (L/D) cycle of 12 hours for the first 7 days, then transferred to constant darkness (D). They later were exposed to a 6-hour light period (LP) to reset the rhythm. The circadian rhythm for the wild-type mouse has a period of 23.1 hours. The period for the heterozygous clock/+ mouse is 24.9 hours. The homozygous clock/clock mice experience a complete loss of circadian rhythmicity on transfer to constant darkness and transiently express a rhythm of 28.4 hours after the light period. (Reproduced, with permission, from Takahashi, Pinto, and Vitaterna. 1994. Copyright © 1994 AAAS.)

شکل 2-12 تنظیم ریتم شبانه روزی توسط ژن ساعت در موش. سوابق دوره‌های فعالیت حرکتی سه حیوان را نشان می‌دهد: نوع وحشی، هتروزیگوت و هموزیگوت. همه حیوانات در یک چرخه نور-تاریکی (L/D) 12 ساعته برای 7 روز اول نگهداری شدند، سپس به تاریکی ثابت (D) منتقل شدند. آنها بعداً در معرض یک دوره نوری 6 ساعته (LP) قرار گرفتند تا ریتم تنظیم مجدد شود. ریتم شبانه روزی برای موش‌های نوع وحشی دارای دوره 23.1 ساعت است. دوره برای ساعت هتروزیگوت/+ ماوس 24.9 ساعت است. موش‌های ساعت/ساعت هموزیگوت با انتقال به تاریکی ثابت، ریتمی‌کامل شبانه‌روزی را از دست می‌دهند و به‌طور گذرا ریتمی‌28.4 ساعت پس از دوره نور را بیان می‌کنند. (تکثیر شده، با اجازه، از تاکاهاشی، پینتو، و ویتاترنا. 1994. حق چاپ © 1994 AAAS.)

1. The transcription of circadian rhythm genes varies with the 24-hour cycle: PER activity is high at night; CLOCK activity is high during the day.

1. رونویسی ژن‌های ریتم شبانه روزی با چرخه 24 ساعته متفاوت است: فعالیت PER در شب زیاد است. فعالیت CLOCK در طول روز زیاد است.

2. The circadian rhythm genes are transcription factors that affect each other’s mRNA level, generating the oscillations. CLOCK activates per transcription and PER represses CLOCK function.

2. ژن‌های ریتم شبانه روزی عوامل رونویسی هستند که بر سطح mRNA یکدیگر تأثیر می‌گذارند و نوسانات را ایجاد می‌کنند. CLOCK در هر رونویسی فعال می‌شود و PER عملکرد CLOCK را سرکوب می‌کند.

3. The circadian rhythm genes also control the transcription of other genes that in turn affect many downstream responses. For example, in flies, the neuropeptide gene pdf controls locomotor activity levels.

3. ژن‌های ریتم شبانه روزی همچنین رونویسی ژن‌های دیگر را کنترل می‌کنند که به نوبه خود بر بسیاری از پاسخ‌های پایین دست تأثیر می‌گذارد. به عنوان مثال، در مگس‌ها، ژن نوروپپتید pdf سطوح فعالیت حرکتی را کنترل می‌کند.

4. The oscillation of these genes can be reset by light.

4. نوسان این ژن‌ها را می‌توان با نور تنظیم مجدد کرد.

The detailed elucidation of this molecular clock mechanism was recognized by the 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine, awarded to Jeffrey Hall, Michael Rosbash, and Michael Young.

توضیح دقیق این مکانیسم ساعت مولکولی توسط جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی 2017 که به جفری‌هال، مایکل روزباش و مایکل یانگ اعطا شد، شناخته شد.

The same genetic network controls circadian rhythm in humans. People with advanced sleep-phase syndrome have short 20-day cycles and an extreme early-to-bed, early-to-rise “morning lark” phenotype. Louis Ptáček and Ying-hui Fu found that these individuals have mutations in a human per gene. These results demonstrate that genes for behavior are conserved from insects to humans. Advanced sleep-phase syndrome is discussed in the chapter on sleep (Chapter 44).

همین شبکه ژنتیکی ریتم شبانه روزی را در انسان کنترل می‌کند. افراد مبتلا به سندرم فاز خواب پیشرفته دارای چرخه‌های 20 روزه کوتاه و یک فنوتیپ افراطی زود به رختخواب و زود برخاستن از “خرچنگ صبحگاهی” هستند. لوئیس پتاچک و یینگ هوی فو دریافتند که این افراد در هر ژن انسان دارای جهش هستند. این نتایج نشان می‌دهد که ژن‌های رفتاری از حشرات به انسان حفظ می‌شوند. سندرم مرحله خواب پیشرفته در فصل خواب (فصل 44) مورد بحث قرار گرفته است.

Natural Variation in a Protein Kinase Regulates Activity in Flies and Honeybees

تنوع طبیعی در یک پروتئین کیناز فعالیت در مگس‌ها و زنبورهای عسل را تنظیم می‌کند

In the genetic studies of circadian rhythm described earlier, random mutagenesis was used to identify genes of interest in a biological process. All normal individuals have functional copies of per, clock, and the related genes; only after mutagenesis were different alleles generated. Another, more subtle question about the role of genes in behavior is to ask which genetic changes may be responsible for behavioral variation among normal individuals. Work by Marla Sokolowski and her colleagues led to the identification of the first gene associated with variation in behavior among nor- mal individuals in a species.

در مطالعات ژنتیکی ریتم شبانه روزی که قبلا توضیح داده شد، جهش زایی تصادفی برای شناسایی ژن‌های مورد علاقه در یک فرآیند بیولوژیکی استفاده شد. همه افراد عادی دارای کپی‌های عملکردی از per، clock و ژن‌های مرتبط هستند. تنها پس از جهش زایی، آلل‌های مختلف تولید شد. سوال ظریف دیگر در مورد نقش ژن‌ها در رفتار این است که بپرسیم کدام تغییرات ژنتیکی ممکن است مسئول تغییرات رفتاری در بین افراد عادی باشد. کار مارلا سوکولوفسکی و همکارانش منجر به شناسایی اولین ژن مرتبط با تغییر رفتار در میان افراد عادی در یک گونه شد.

Larvae of Drosophila vary in activity level and locomotion. Some larvae, called rovers, move over long distances (Figure 2-14). Others, called sitters, are relatively stationary. Drosophila larvae isolated from the wild can be either rovers or sitters, indicating that these are natural variations and not laboratory-induced mutations. These traits are heritable; rover parents have rover off- spring and sitter parents have sitter offspring.

لارو مگس سرکه در سطح فعالیت و حرکت متفاوت است. برخی از لاروها به نام مریخ نوردها در فواصل طولانی حرکت می‌کنند (شکل 2-14). برخی دیگر که سیتر نامیده می‌شوند، نسبتا ثابت هستند. لاروهای مگس سرکه از طبیعت جدا شده اند می‌توانند مریخ نورد یا نشسته باشند، که نشان می‌دهد اینها تغییرات طبیعی هستند و جهش‌های ناشی از آزمایشگاه نیستند. این صفات ارثی هستند. والدین مریخ نورد دارای فرزندان مریخ نورد و والدین نشسته دارای فرزندان نشسته هستند.

Sokolowski used crosses between different wild flies to investigate the genetic differences between rover and sitter larvae. These crosses showed that the difference between rover and sitter larvae lies in a single major gene, the for (forager) locus. The for gene encodes a signal transduction enzyme, a protein kinase activated by the cellular metabolite cGMP (cyclic guanosine 3′,5′-monophosphate). Thus this natural variation in behavior arises from altered regulation of signal transduction pathways. Many neuronal functions are regulated by protein kinases such as the cGMP-dependent kinase encoded by the for gene. Molecules such as protein kinases are particularly significant at transforming short-term neural signals into long-term changes in the property of a neuron or circuit.

سوکولوفسکی از تلاقی بین مگس‌های وحشی مختلف برای بررسی تفاوت‌های ژنتیکی بین لارو مریخ نورد و سیتر استفاده کرد. این تلاقی‌ها نشان داد که تفاوت بین لارو مریخ نورد و سیتر در یک ژن اصلی، مکان for (forager) نهفته است. ژن for یک آنزیم انتقال سیگنال، یک پروتئین کیناز فعال شده توسط متابولیت سلولی cGMP (گوانوزین حلقوی 3’،5′-مونوفسفات) را کد می‌کند. بنابراین این تغییر طبیعی در رفتار از تنظیم تغییر مسیرهای انتقال سیگنال ناشی می‌شود. بسیاری از عملکردهای عصبی توسط پروتئین کینازها مانند کیناز وابسته به cGMP که توسط ژن for کدگذاری می‌شود، تنظیم می‌شوند. مولکول‌هایی مانند پروتئین کینازها به ویژه در تبدیل سیگنال‌های عصبی کوتاه مدت به تغییرات بلندمدت در ویژگی یک نورون یا مدار مهم هستند.

Figure 2-13 Molecular events that drive circadian rhythm. The genes that control the circadian clock are regulated by two nuclear proteins, PER and TIM. These proteins slowly accumulate and then bind to one another to form dimers. Once they form dimers, they enter the nucleus and shut off the expression of circadian genes including their own. They do so by inhibiting CLOCK and CYCLE, which stimulate the transcription of per and tim genes.

شکل 2-13 رویدادهای مولکولی که ریتم شبانه روزی را هدایت می‌کنند. ژن‌هایی که ساعت شبانه روزی را کنترل می‌کنند توسط دو پروتئین هسته ای PER و TIM تنظیم می‌شوند. این پروتئین‌ها به آرامی‌جمع می‌شوند و سپس به یکدیگر متصل می‌شوند تا دایمر تشکیل دهند. پس از تشکیل دایمر، آنها وارد هسته می‌شوند و بیان ژن‌های شبانه روزی از جمله ژن‌های خود را متوقف می‌کنند. آنها این کار را با مهار CLOCK و CYCLE انجام می‌دهند که رونویسی ژن‌های per و time را تحریک می‌کنند.

PER protein is highly unstable; most of it is degraded so quickly that it never has a chance to repress CLOCK-dependent per transcription. The degradation of PER is regulated by at least two different phosphorylation events by different protein kinases. When PER binds to TIM, PER is protected from degradation. As CLOCK drives more and more per and tim expression, enough PER and TIM eventually accumulate that the two can bind and stabilize each other, at which point they enter the nucleus where their own transcription is repressed. As a result, per and tim mRNA levels fall; thereafter, PER and TIM protein levels fall and CLOCK can (once again) drive expression of per and tim mRNA. During daylight, TIM protein is degraded by signaling pathways that are regulated by light (including cryptochrome), so PER/TIM complexes form only at night. The CLOCK protein induces PER and TIM expression but is inhibited by PER and TIM proteins.

پروتئین PER بسیار ناپایدار است. بیشتر آن به سرعت تخریب می‌شود که هرگز فرصتی برای سرکوب وابسته به ساعت در هر رونویسی ندارد. تخریب PER توسط حداقل دو رویداد مختلف فسفوریلاسیون توسط پروتئین کینازهای مختلف تنظیم می‌شود. هنگامی‌که PER به TIM متصل می‌شود، PER از تخریب محافظت می‌شود. همانطور که CLOCK بیشتر و بیشتر در برابر و زمان بیان می‌کند، در نهایت PER و TIM به اندازه کافی جمع می‌شوند که این دو می‌توانند یکدیگر را متصل کرده و تثبیت کنند، در این مرحله آنها وارد هسته ای می‌شوند که رونویسی خودشان سرکوب می‌شود. در نتیجه، سطوح mRNA per و tim کاهش می‌یابد. پس از آن، سطح پروتئین PER و TIM کاهش می‌یابد و CLOCK می‌تواند (یک بار دیگر) بیان mRNA per و tim را تحریک کند. در طول روز، پروتئین TIM توسط مسیرهای سیگنالی که توسط نور تنظیم می‌شوند (از جمله کریپتوکروم) تخریب می‌شود، بنابراین کمپلکس‌های PER/TIM فقط در شب تشکیل می‌شوند. پروتئین CLOCK بیان PER و TIM را القا می‌کند اما توسط پروتئین‌های PER و TIM مهار می‌شود.

Figure 2-14 Foraging behavior of Drosophila melanogaster rover and sitter larvae differs while feasting on patches of yeast. (Reproduced, with permission, from Sokolowski. 2001. Copyright 2001 Springer Nature.)

A. Rover-type larvae move from patch to patch, whereas sitter- type larvae stay put on a single patch for a long time. When foraging within a single patch, rover larvae move about more than sitter larvae. On agar alone, rover and sitter larvae move about equally. 

B. While foraging within a patch of food, rovers have longer trail lengths than sitters (trail lengths were measured over a period of 5 minutes).

This difference in foraging behavior maps to a single protein kinase gene, for, which varies in activity in different fly larvae.

شکل 2-14 رفتار جستجوی غذای مریخ نورد مگس سرکه و لاروهای نشسته در هنگام غذا خوردن روی تکه‌های مخمر متفاوت است. (تکثیر، با اجازه، از Sokolowski. 2001. حق چاپ 2001 Springer Nature.)

الف. لاروهای نوع مریخ نورد از تکه ای به تکه دیگر حرکت می‌کنند، در حالی که لاروهای نوع نشسته برای مدت طولانی روی یک تکه می‌مانند. هنگام جستجوی غذا در یک تکه، لاروهای مریخ نورد بیشتر از لاروهای نشسته حرکت می‌کنند. تنها روی آگار، لاروهای مریخ نورد و سیتر به طور مساوی حرکت می‌کنند.

ب. هنگام جستجوی علوفه در یک تکه غذا، مریخ نوردها طول مسیرهای طولانی تری نسبت به سیترها دارند (طول مسیر طی یک دوره 5 دقیقه اندازه گیری شد).

این تفاوت در رفتار جستجوی غذا به یک ژن پروتئین کیناز منفرد مربوط می‌شود، که فعالیت آن در لاروهای مختلف مگس متفاوت است.

Why would variability in signaling enzymes be preserved in wild populations of Drosophila, which typically include both rovers and sitters? The answer is that variations in the environment create pressure for balanced selection for alternative behaviors. Crowded environments favor the rover larva, which is more effective at moving to new, unexploited food sources in advance of competitors, whereas sparse environments favor the sitter larva, which exploits the current source more thoroughly.

چرا تنوع در آنزیم‌های سیگنال‌دهنده در جمعیت‌های وحشی مگس سرکه معمولاً شامل مریخ نوردها و سیترها می‌شود، حفظ می‌شود؟ پاسخ این است که تغییرات در محیط باعث ایجاد فشار برای انتخاب متعادل برای رفتارهای جایگزین می‌شود. محیط‌های شلوغ به نفع لارو مریخ نورد است که در حرکت به سمت منابع غذایی جدید و بهره برداری نشده قبل از رقبا موثرتر است، در حالی که محیط‌های پراکنده به نفع لارو نشسته است که منبع فعلی را به طور کامل تر مورد بهره برداری قرار می‌دهد.

The for gene is also found in honeybees. Honey- bees exhibit different behaviors at different stages of their life; in general, young bees are nurses, while older bees become foragers that leave the hive. The for gene is expressed at high levels in the brains of active foraging honeybees and at low levels in the younger and more stationary nurse bees. Activation of cGMP signaling in young bees can cause them to enter the forager stage prematurely; this change could be induced by an environmental stimulus or the bee’s advancing age.

ژن for در زنبورهای عسل نیز یافت می‌شود. زنبورهای عسل در مراحل مختلف زندگی خود رفتارهای متفاوتی از خود نشان می‌دهند. به طور کلی، زنبورهای جوان پرستار هستند، در حالی که زنبورهای مسن تر علوفه جو می‌شوند که کندو را ترک می‌کنند. ژن for در سطوح بالایی در مغز زنبورهای عسل جستجوگر فعال و در سطوح پایین در زنبورهای پرستار جوان تر و ساکن تر بیان می‌شود. فعال سازی سیگنالینگ cGMP در زنبورهای جوان می‌تواند باعث شود که آنها زودتر وارد مرحله جستجوگر شوند. این تغییر می‌تواند توسط یک محرک محیطی یا افزایش سن زنبور عسل ایجاد شود.

Thus the same gene controls variation in a behavior in two different insects, but in different ways. In the fruit fly, variations in the behavior are expressed in different individuals, whereas in the honeybee, they are expressed in one individual at different ages. Th difference illustrates how an important regulatory gene can be recruited to different behavioral strategies in different species.

بنابراین یک ژن تغییر رفتار را در دو حشره متفاوت، اما به روش‌های متفاوت، کنترل می‌کند. در مگس میوه، تغییرات در رفتار در افراد مختلف بیان می‌شود، در حالی که در زنبور عسل، در یک فرد در سنین مختلف بیان می‌شود. این تفاوت نشان می‌دهد که چگونه یک ژن تنظیم کننده مهم می‌تواند برای استراتژی‌های رفتاری مختلف در گونه‌های مختلف به کار گرفته شود.

Neuropeptide Receptors Regulate the Social Behaviors of Several Species

گیرنده‌های نوروپپتیدی رفتارهای اجتماعی چندین گونه را تنظیم می‌کنند

Many aspects of behavior are associated with an animal’s social interactions with other animals. Social behaviors are highly variable between species, yet have a large innate component within a species that is controlled genetically. A simple form of social behavior has been analyzed in the roundworm Caenorhabditis elegans. These animals live in soil and eat bacteria.

بسیاری از جنبه‌های رفتار با تعاملات اجتماعی حیوان با حیوانات دیگر مرتبط است. رفتارهای اجتماعی بین گونه‌ها بسیار متغیر است، با این حال دارای یک جزء ذاتی بزرگ در یک گونه است که از نظر ژنتیکی کنترل می‌شود. شکل ساده ای از رفتار اجتماعی در کرم گرد Caenorhabditis elegans تحلیل شده است. این حیوانات در خاک زندگی می‌کنند و باکتری‌ها را می‌خورند.

Different wild-type strains exhibit profound differences in feeding behavior. Animals from the standard laboratory strain are solitary, dispersing across a lawn of bacterial food and failing to interact with each other. Other strains have a social feeding pattern, joining large feeding groups of dozens or hundreds of animals (Figure 2-15). The difference between these strains is genetic, as both feeding patterns are stably inherited.

سویه‌های مختلف از نوع وحشی تفاوت‌های عمیقی را در رفتار تغذیه نشان می‌دهند. حیوانات از سویه آزمایشگاهی استاندارد منفرد هستند، در چمنزار غذای باکتریایی پراکنده می‌شوند و با یکدیگر تعامل ندارند. سویه‌های دیگر دارای الگوی تغذیه اجتماعی هستند و به گروه‌های تغذیه ای بزرگ متشکل از ده‌ها یا صدها حیوان می‌پیوندند (شکل 2-15). تفاوت بین این سویه‌ها ژنتیکی است، زیرا هر دو الگوی تغذیه به طور پایدار به ارث می‌رسند.

The difference between social and solitary worms is caused by a single amino acid substitution in a single gene, a member of a large family of genes involved in signaling between neurons. This gene, npr-1, encodes a neuropeptide receptor. Neuropeptides have long been appreciated for their roles in coordinating behaviors across networks of neurons. For example, a neuropeptide hormone of the marine snail Aplysia stimulates a complex set of movements and behavior patterns associated with a single behavior, egg laying. Mammalian neuropeptides have been implicated in feeding behavior, sleep, pain, and many other behaviors and physiological processes. The existence of a mutation in the neuropeptide receptor that alters social behavior suggests that this kind of signaling molecule is important both for generating the behavior and for generating the variation between individuals.

تفاوت بین کرم‌های اجتماعی و منفرد ناشی از جایگزینی اسید آمینه منفرد در یک ژن است، عضوی از خانواده بزرگی از ژن‌هایی که در سیگنال‌دهی بین نورون‌ها نقش دارند. این ژن، npr-1، یک گیرنده نوروپپتیدی را کد می‌کند. نوروپپتیدها مدت‌هاست که به خاطر نقش‌هایشان در هماهنگی رفتارها در شبکه‌های عصبی مورد قدردانی قرار گرفته‌اند. به عنوان مثال، یک هورمون نوروپپتیدی در حلزون دریایی Aplysia مجموعه پیچیده ای از حرکات و الگوهای رفتاری مرتبط با یک رفتار واحد، یعنی تخمگذاری را تحریک می‌کند. نوروپپتیدهای پستانداران در رفتار تغذیه، خواب، درد و بسیاری دیگر از رفتارها و فرآیندهای فیزیولوژیکی نقش دارند. وجود یک جهش در گیرنده نوروپپتیدی که رفتار اجتماعی را تغییر می‌دهد نشان می‌دهد که این نوع مولکول سیگنال‌دهنده هم برای ایجاد رفتار و هم برای ایجاد تنوع بین افراد مهم است.

Figure 2-15 Feeding behavior of the roundworm Caenorhabditis elegans depends on the level of activity of the gene coding for a neuropeptide receptor. In one strain, individual worms graze in isolation (left), whereas in another strain, individuals mass together to feed. The difference is explained by a single amino acid substitution in the neuropeptide receptor gene. (Reproduced, with permission, from De Bono and Bargmann 1998.)

شکل 2-15 رفتار تغذیه کرم گرد Caenorhabditis elegans به سطح فعالیت ژن کد کننده گیرنده نوروپپتیدی بستگی دارد. در یک سویه، کرم‌های منفرد به صورت مجزا (سمت چپ) می‌چرند، در حالی که در سویه دیگر، افراد برای تغذیه با هم جمع می‌شوند. این تفاوت با یک جایگزین اسید آمینه منفرد در ژن گیرنده نوروپپتید توضیح داده می‌شود. (بازتولید شده، با اجازه، از De Bono و Bargmann 1998.)

Neuropeptide receptors have also been implicated in the regulation of mammalian social behavior. The neuropeptides oxytocin and vasopressin stimulate mammalian affiliative behaviors such as pair bonding and parental bonding with offspring. In mice, oxytocin is required for social recognition, the ability to identify a familiar individual. Oxytocin and vasopressin have been studied in depth in prairie voles, rodents that form lasting pairs to raise their young. Oxytocin released in the brain of female prairie voles during mating stimulates pair-bond formation. Likewise, vasopressin released in the brain of male prairie voles during mating stimulates pair-bond formation and paternal behavior.

گیرنده‌های نوروپپتیدی نیز در تنظیم رفتار اجتماعی پستانداران نقش دارند. نوروپپتیدهای اکسی توسین و وازوپرسین رفتارهای وابستگی پستانداران مانند پیوند جفتی و پیوند والدین با فرزندان را تحریک می‌کنند. در موش‌ها، اکسی توسین برای شناخت اجتماعی، توانایی شناسایی یک فرد آشنا مورد نیاز است. اکسی توسین و وازوپرسین به طور عمیق در موش‌های چمنزار مورد مطالعه قرار گرفته اند، جوندگانی که جفت‌های ماندگاری را برای بزرگ کردن بچه‌های خود تشکیل می‌دهند. اکسی توسین آزاد شده در مغز حشرات ماده در طول جفت گیری، تشکیل جفت پیوند را تحریک می‌کند. به همین ترتیب، وازوپرسین آزاد شده در مغز حوضچه‌های دشت نر در طول جفت گیری، تشکیل جفت پیوند و رفتار پدری را تحریک می‌کند.

The extent of pair-bonding varies substantially between mammalian species. Male prairie voles form long-lasting pair-bonds with females and help them raise their offspring and are described as monogamous, but the closely related male montane voles breed widely and do not engage in paternal behavior. The difference between the behaviors of males in these species correlates with differences in the expression of the Vla class of vasopressin receptors in the brain. In prairie voles, Vla vasopressin receptors are expressed at high levels in a specific brain region, the ventral pallidum (Figure 2-16). In montane voles, the levels are much lower in this region, although high in other brain regions.

میزان پیوند جفتی به طور قابل ملاحظه ای بین گونه‌های پستانداران متفاوت است. ولهای نر دشتی پیوندهای جفتی طولانی مدتی با ماده‌ها ایجاد می‌کنند و به آنها کمک می‌کنند فرزندان خود را بزرگ کنند و به عنوان تک همسر توصیف می‌شوند، اما حشرات نر کوهستانی به طور گسترده تولید مثل می‌کنند و رفتار پدرانه ندارند. تفاوت بین رفتارهای نرها در این گونه‌ها با تفاوت در بیان کلاس Vla گیرنده‌های وازوپرسین در مغز ارتباط دارد. در دشت‌زارها، گیرنده‌های وازوپرسین Vla در سطوح بالایی در یک ناحیه خاص مغز، پالیدوم شکمی، بیان می‌شوند (شکل 2-16). در ولزهای کوهستانی، سطح آن در این ناحیه بسیار کمتر است، اگرچه در سایر مناطق مغز بالا است.

The importance of oxytocin and vasopressin and their receptors has been confirmed and extended by reverse genetic studies in mice, which are easier than voles to manipulate genetically. Introducing the Vla vasopressin receptor gene from prairie voles into male mice, which behave more like montane voles, increases the expression of the Vla vasopressin receptor in the ventral pallidum and increases the affiliative behavior of the male mice toward females. Thus differences between species in the pattern of expression of the vasopressin receptor can contribute to differences in social behaviors.

اهمیت اکسی توسین و وازوپرسین و گیرنده‌های آنها توسط مطالعات ژنتیکی معکوس در موش‌ها تأیید و گسترش یافته است که دستکاری ژنتیکی آنها آسان‌تر از موش‌ها است. معرفی ژن گیرنده وازوپرسین Vla از حوضچه‌های چمنزار به موش‌های نر که بیشتر شبیه موش‌های کوهستانی رفتار می‌کنند، بیان گیرنده وازوپرسین Vla را در پالیدوم شکمی‌افزایش می‌دهد و رفتار وابستگی موش‌های نر نسبت به ماده‌ها را افزایش می‌دهد. بنابراین تفاوت بین گونه‌ها در الگوی بیان گیرنده وازوپرسین می‌تواند به تفاوت در رفتارهای اجتماعی کمک کند.

The analysis of vasopressin receptors in different rodents provides insight into the mechanisms by which genes and behaviors can change during evolution. Thus evolutionary changes in the pattern of expression of the Vla vasopressin receptor in the ventral forebrain have altered the activity of a neural circuit, linking the function of the ventral forebrain to the function of the vasopressin-secreting neurons that are activated by mating. As a result, social behaviors are altered.

تجزیه و تحلیل گیرنده‌های وازوپرسین در جوندگان مختلف بینشی را در مورد مکانیسم‌هایی که توسط آن ژن‌ها و رفتارها می‌توانند در طول تکامل تغییر کنند، ارائه می‌دهد. بنابراین تغییرات تکاملی در الگوی بیان گیرنده وازوپرسین Vla در جلوی مغز شکمی، فعالیت یک مدار عصبی را تغییر داده است و عملکرد مغز جلوی شکمی‌را به عملکرد نورون‌های ترشح کننده وازوپرسین که با جفت‌گیری فعال می‌شوند، مرتبط می‌کند. در نتیجه رفتارهای اجتماعی تغییر می‌کند.

The importance of oxytocin and vasopressin in human social behavior is not known, but the central role of pair-bonding and pup rearing in mammalian species suggests that these molecules might play a role in our species as well.

اهمیت اکسی توسین و وازوپرسین در رفتار اجتماعی انسان مشخص نیست، اما نقش اصلی پیوند جفتی و پرورش توله سگ در گونه‌های پستانداران نشان می‌دهد که این مولکول‌ها ممکن است در گونه ما نیز نقش داشته باشند.

Figure 2-16 Distribution of vasopressin receptors (V1a) in two closely related rodent species. (Adapted, with permission, from Young et al. 2001. Copyright © 2001 Academic Press.)

A. Receptor expression is high in the lateral septum (LS) but low in the ventral pallidum (VP) in the montane vole, which does not form pair bonds.

B. Expression is high in the ventral pallidum of the monogamous prairie vole. Expression of the receptor in the ventral pallidum allows vasopressin to link the social recognition pathway to the reward pathway.

شکل 2-16 توزیع گیرنده‌های وازوپرسین (V1a) در دو گونه جونده نزدیک به هم. (اقتباس شده، با اجازه، از یانگ و همکاران 2001. حق چاپ © 2001 Academic Press.)

الف. بیان گیرنده در سپتوم جانبی (LS) زیاد است اما در پالیدوم شکمی‌(VP) در ول کوهی کم است که پیوندهای جفتی ایجاد نمی‌کند.
ب. بیان در رنگ پری شکمی‌چمنزار تک همسری زیاد است. بیان گیرنده در پالیدوم شکمی‌به وازوپرسین اجازه می‌دهد تا مسیر شناخت اجتماعی را به مسیر پاداش پیوند دهد.