علوم پزشکیمیکروبیولوژی

رنگ‌آمیزی میکروارگانیسم‌ها؛ اهمیت رنگ‌آمیزی باکتری‌؛ روش‌های رنگ‌آمیزی

امتیازی که به این مقاله می دهید چند ستاره است؟
[کل: ۰ میانگین: ۰]

رنگ آمیزی میکروارگانیسم‌ها

هدف‌های رفتاری: در پایان این مطلب، فراگیر باید بتواند:

١- گسترشی تهیه و آن را رنگ آمیزی نماید و باکتری‌ها را زیر میکروسکوپ مورد مشاهده قرار دهد.

۲- تئوری رنگ آمیزی و اهمیت آن را بیان نماید.

۳- یک نوع رنگ آمیزی ساده را انجام دهد.

۴- یک نوع رنگ آمیزی تشخیصی انجام دهد.

۶- رنگ آمیزی میکروارگانیسم‌ها

اهمیت رنگ آمیزی باکتری‌ها

مورفولوژی باکتری‌ها را به دو طریق می توان مورد بررسی قرار داد:

١- به وسیله‌ی مشاهده‌ی موجودات زنده و بدون رنگ آمیزی.

۲- به وسیله‌ی مشاهده‌ی سلولهای مرده و رنگ شده با مواد رنگی.

باکتری‌های زنده بی رنگ اند، و تضاد کافی با آبی که در آن معلق هستند ندارند و در نتیجه خوب دیده نمی‌شوند. رنگ آمیزی موجودات باعث می‌شود که بین آنها و محیط اطرافشان تضاد رنگی حاصل شود و بدین طریق بهتر دیده بشوند. همینطور بعضی از رنگ هایی که بکار می‌روند، می توانند ساختمان‌های داخلی سلول را که به طور طبیعی غیر قابل رؤشیت هستند، مشخص کنند. اگر چه باکتریها با محیط اطرافشان اختلاف زیادی نشان نمی‌دهند، ولی از نظر شیمیایی از محیط خود متفاوت هستند. این اختلاف شیمیایی ما را در تشخیص باکتری‌ها به وسیله‌ی رنگ آمیزی توانا می سازد، زیرا رنگ یا ماده به طور معمول با سلول باکتری واکنش ایجاد می‌کند، در حالی که روی زمینه لام اثری ندارد. بنابراین، مزایای اصلی رنگ آمیزی عبارت است از ۱- ایجاد تضاد بین میکروارگانیسم‌ها و زمینه‌ی آنها، که در نتیجه باعث تمایز اشکال مختلف می‌شود. ۲- امکان بررسی ساختمانهای داخلی سلول باکتریها، مثل دیوارهای سلولی، واکوئول (Vacuole)، یا ضمائم هسته (Nuclearbodies) را فراهم می‌نماید. ۳- به باکتری شناس امکان می‌دهد که از درشت نمایی بیشتر استفاده کنند.

تئوری رنگ‌آمیزی

برای درک این که یک ماده رنگی سلول باکتری‌ها را رنگ می‌کند، ابتدا باید بدانید که یک ماده‌ی رنگی چیست. مواد رنگی اغلب املاحی هستند که یکی از یون‌های آن‌ها رنگی است یک ملح یا نمک ترکیبی است که از یک یون با بار الکتریکی مثبت و یک یون با بار الکتریکی منفی تشکیل شده است ماده رنگی ساده متیلن بلو در حقیقت ملح کلرور متیلن بلو می باشد که تجزیه آن به شرح ذیل است

کلرور + متیلن بلو+ → کلرور متیلن بلو

قسمت رنگی این ماده در یون مثبت متیلن بلو قرار دارد. سلول باکتری‌ها هنگامی‌که در محیطی قرار بگیرد که دارای pH حدود خنثی باشد که به طور معمول چنین است ، دارای بار الکتریکی منفی مختصری خواهند بود. سلول باکتری با بار الکتریکی منفی با یون متیلن بلو با بار الکتریکی مثبت ترکیب شده و در نتیجه سلول رنگ می‌شود. در حقیقت تفاوت بار الکتریکی است که باعث گرایش بین ماده رنگی و سلول باکتری می‌شود.

روش‌های رنگ آمیزی

امروزه تعداد زیادی مواد رنگی در اختیار باکتری شناسان است که به اشکال متفاوت در روشهای رنگ آمیزی اصلی به کار می‌روند.

الف) رنگ آمیزی‌های ساده: شامل رنگ آمیزی با مواد رنگی قلیایی، مواد رنگی اسیدی و مواد رنگی خنثی می باشد

١- رنگهای اسیدی: رنگ هایی هستند که قسمت رنگی آنها (کروموفور) دارای بار منفی می باشد و با قسمت هایی از سلول که بار مثبت دارند مثل پروتئین‌ها ترکیب می‌شوند مثل اسید پیکریک و نیگروزین و فوشین اسیدی

۲- رنگ‌های قلیایی: قسمت رنگی (کروموفور) این گروه دارای بار مثبت می باشد و با قسمتهایی از سلول که بار منفی دارند مثل اسیدهای نوکلئیک ترکیب می‌شوند از این گروه می توان به کریستال ویوله (بنفش)، متیلن بلو سافرانین و فوشین بازی اشاره کرد.

٣- رنگ‌های خنثی: رنگ هایی هستند که قسمت رنگی آنها فاقد بار الکتریکی می باشد و با قسمت‌های بدون بار الکتریکی سلول مثل چربیها، ترکیب می‌شوند مثل سودان سیاه

ب) رنگ آمیزی‌های تشخیصی(Differential): شامل رنگ آمیزی گرم (Gram stain) و رنگ آمیزی اسید فست (Acid fast stain)

– طرز تهیه و تثبیت باکتری‌ها برای رنگ آمیزی

پیش از رنگ آمیزی باید باکتری هایی را که می خواهید مورد بررسی قرار دهید تثبیت کنید، یعنی آنها را به لام شیشه‌ای که باید رنگ شود بچسبانید. اگر یک نمونه تثبیت نشده باشد لایه‌ی سلولی در حین عملیات مربوط به رنگ آمیزی شسته شده، از بین خواهد رفت. روشی که در این آزمایش ذکر می‌شود، خیلی معمول است و به عنوان کار اولیه در بیشتر روش‌های رنگ آمیزی باکتریها بکار می‌رود. در این آزمایش، از حرارت برای کشتن و چسباندن سلولها به لام استفاده می‌شود.

۱- با یک سوزن کشت حلقه ای، یک قطره کوچک از هر کدام از کشت‌های موردنظر را برداشته و روی لام‌های جداگانه تمیز قرار دهید لازم است لام‌ها تمیز باشد. روشی که برای تمیز کردن پیشنهاد می‌شود عبارتست از الف) یک قطره گزیلول (xylol) روی سطح لام قرار دهید. ب) به کمک کاغذ مخصوص عدسی یا پارچه آن را پاک کنید. ج) لام تمیز شده را از میان شعله چراغ عبور داده و بگذارید تا سرد شود. یا اگر نمونه از روی محیط جامد برداشته می‌شود، یک قطره کوچک آب روی لام گذاشته، آن را با یک تکه کوچک از کشت باکتری به طور کامل مخلوط کنید.

۲- قطره روی لام را گسترده و پخش کنید تا یک لایه‌ی نازک و یکنواخت تشکیل شود. توجه داشته باشید که اگر گستره کلفت باشد شمارش را دچار اشکال می‌کند.

۳- مقداری بزاق را در یک لوله آزمایش استریل جمع آوری کنید. به کمک یک حلقه استریل یک حلقه از آن را روی لام تمیز قرار داده، آن را گسترده کنید، تا یک لایه نازک را تشکیل بدهد.

۴- لام‌ها را در هوا و یا با نگهداشتن در قسمت بالای شعله گاز خشک کنید.

۵- هنگامی‌که لایه‌های میکروبی خشک شد، لام را سه بار از درون شعله گاز عبور دهید. به طوری که قسمت لایه‌ی میکروبی به طرف بالا باشد. توجه کنید که گرمای زیاد باعث تغییر شکل ساختمان طبیعی میکروارگانیسم‌های رنگ شده خواهد شد. اگر لام گرم شده را پشت دست قرار دهیم ، باید گرمای آن حس شود ولی داغ و سوزنده نباشد. منظور از تثبیت عبارتست از کشتن میکروارگانیسم ها،

تهیه گستره و تثبیت میکروارگانیسم‌ها برای رنگ آمیزیشکل ۱- تهیه گستره و تثبیت میکروارگانیسم‌ها برای رنگ آمیزی

انعقاد پروتوپلاسم سلولها، و همینطور که گفته شد، چسباندن آنها به لام. یک عامل تثبیت‌کننده مناسب، ساختمانهای سلول را به همان شکل و موقعیت ویژه خود بدون اینکه ایجاد تغییرات ساختمانهایی که در سلول زنده وجود ندارد) بکند حفظ می‌نماید. به طور معمول برای تثبیت از روش گرم کردن ملایم استفاده می‌شود، ولی از عوامل الکل و مواد شیمیایی دیگر هم می توان استفاده کرد.

رنگ آمیزی‌های ساده

الف) رنگ آمیزی با رنگ‌های قلیایی: رنگ آمیزی با رنگ‌های قلیایی متیلن بلو، کریستال ویوله (Crystal Violet) و کربول فوشین (Carbol fuchsin) حدود ۳۰ تا ۶۰ ثانیه وقت لازم دارد. کریستال ویوله دارای قدرت واکنش بیشتر است و به طور معمول برای رنگ کردن احتیاج به حدود ۱۰ ثانیه وقت دارد. کربول فوشین که مخلوطی از فوشین وفنل است رنگ قویتری می باشد و به طور معمول ۵ ثانیه وقت لازم دارد. قدرت واکنش کربول فوشین آنقدر بالاست که ممکن است به دلیل زیاد رنگ کردن مشکلاتی ایجاد کند، به ویژه در نمونه هایی که حاوی مقدار زیادی مواد و عناصر آلی باشند.

ب) مراحل رنگ آمیزی:

١- لام هایی را که در قسمت اول آزمایش تثبیت کردید روی صفحه سیمی‌مخصوص رنگ آمیزی که روی ظرف مخصوص مایعات زائد است قرار دهید.

۲- هریک از لایه‌های میکروبی تثبیت شده را با تقریبا ۵ قطره از یکی از رنگها آغشته کرده ، بگذارید تا با گذشت زمان رنگ آمیزی انجام شود، در مورد متیلن بلو، ۳۰ ثانیه، کریستال ویوله، ۱۰ ثانیه، و کربول فوشین ۵ ثانیه.

٣- نمونه‌های رنگ شده را با آب فشان شستشو دهید.

۴- لام‌ها را بین کاغذ آب خشک کن بدون وارد کردن فشار روی لامل یا در هوای بالای شعله خشک کنید.

۵- نمونه‌های رنگ شده را زیر میکروسکوپ گذاشته و با عدسی روغنی ایمرسیون مشاهده کرده، از یک میدان میکروسکوپی خوب، اشکال میکروبی را رسم کنید. اگر گسترشهای میکروبی کلفت تهیه کرده باشید، در این مرحله مشخص خواهد شد. در لایه‌های میکروبی کلفت توده‌ای از مواد رنگ شده دیده می‌شود که ممکن است در آن تعدادی هم سلول جدا و منفرد وجود داشته باشد.

تفاوتهای مشخص مربوط به اندازه‌ی سلول ها، شکل و ترتیب آنها را به دقت مورد ملاحظه قرار دهید. در بزاق رنگ شده انواع زیاد و گوناگونی سلول دیده می‌شود. چندین نوع باکتری و قارچ، سلول‌های اپی تلیال (Epithelial)، ذرات بزاقی، و گلبولهای سفید خون، بیشتر بار الکتریکی یک باکتری (یا یک پروتئین) مربوط به اسیدی بودن محیط است اگر اسیدیته کاهش پیدا کند (بالا رفتن pH) بار الکتریکی منفی سلول افزایش یافته، و در نتیجه گرایش آن به رنگ‌های قلیایی قویتر می‌شود. در مورد رنگ‌های اسیدی، عکس این مطلب صادق است. بنابراین رنگهای قلیایی در pHهای پایین و رنگهای اسیدی در pH‌های بالا دارای قدرت رنگ آمیزی ضعیفی هستند.

فکر کنید و پاسخ دهید:

آیا می توانید بگویید که تمام باکتریهای جداشده کشت خالص هستند؟

روش‌های رنگ آمیزی تشخیصی (Differential Staining): اساس رنگ آمیزی‌های ساده بر این حقیقت بنا شده است که سلول باکتریها از نظر شیمیایی از محیط اطرافشان متفاوت است و بنابراین می توانند پس از رنگ آمیزی از محیط خود متمایز شوند. خود میکروارگانیسم‌ها هم دارای اختلافات شیمیایی و فیزیکی هستند و بدین طریق در مقابل یک روش رنگ آمیزی معین واکنش‌های متفاوتی نشان می‌دهند. این اصلی است که بر اساس آن رنگ آمیزی‌های تشخیصی بنا شده است. بنابراین رنگ آمیزی تشخیصی روشی است که با آن انواع باکتری‌ها را می توانیم مشخص کنیم.

الف) رنگ آمیزی گرم (Gram Stain): رنگ آمیزی گرم که بیشتر از هر روش دیگری در باکتریولوژی به کار می‌رود رنگ آمیزی تشخیصی است. با به کار بردن این روش می توان باکتریها را به دو گروه تقسیم کرد: گرم مثبت و گرم منفی.

تصور می‌شود که این تمایز رنگی مربوط به اختلاف لایه‌ی سطحی یا دیوارهای سلولی این دو نوع می باشد. به طور کلی میکرو ارگانیسم‌های گرم مثبت و گرم منفی در مقابل بسیاری از عوامل فیزیکی و شیمیایی واکنش‌های مختلفی نشان می‌دهند. در رنگ آمیزی گرم چهار محلول مختلف مورد نیاز است. یک رنگ قلیایی، یک دندانه (Mordant) یک عامل رنگ بر (Decolorizing Agent) و یک رنگ دوم. درباره رنگ قلیایی بحث شده است. دندانه ماده‌ای است که گرایش یا جذب ماده رنگی را به سلول افزایش می‌دهد، یعنی به شکلی، تثبیت رنگ را در روی سلول تسهیل می‌کند. اسیدها، قلیایی ها، املاح معدنی و ید را می توان به عنوان دندانه مثال زد. سلولی که روی آن ریخته شده دندانه بیشتر و بهتر رنگ می‌شود.

رنگ آمیزی گرم. باکتری‌های گرم مثبت به رنگ بنفش یا ارغوانی و باکتری‌های گرم منفی به رنگ صورتیشکل ۲- رنگ آمیزی گرم. باکتری‌های گرم مثبت به رنگ بنفش یا ارغوانی و باکتری‌های گرم منفی به رنگ صورتی

همین طور بعد از به کار بردن دندانه شستن و از بین بردن رنگ دشوارتر است. عامل رنگ بر، همان طور که از اسمش معلوم است، ماده‌ای است که رنگ را از یک سلول رنگ شده خارج می‌کند. بعضی از سلول‌های رنگ شده راحتتر از سلول‌های دیگر بی رنگ می‌شوند. در رنگ آمیزی گرم و در سایر روش‌های رنگ آمیزی تشخیصی از این تفاوت در میزان بی رنگ شدن استفاده کرده، انواع مختلف باکتری‌ها را از یکدیگر متمایز می‌کنیم. رنگ دوم، یک ماده رنگی قلیایی است که از نظر رنگ با ماده رنگی اولیه متفاوت است. منظور از به کار گیری رنگ دوم عبارتست از رنگ کردن سلول‌های بی رنگ شده به وسیله‌ی رنگی که با رنگ اولیه متفاوت است. میکرو ارگانیسم هایی که رنگ اولیه خود را از دست نداده اند رنگ قلیایی اولیه را نگه می‌دارند و آنهایی که رنگ خود را از دست داده اند رنگ دوم را جذب می‌کنند. رنگ آمیزی گرم در مرحله اول عبارتست از رنگ شدن سلول‌ها با یک رنگ قلیایی. این عمل با مجاور کردن سلول‌های رنگ شده با یک دندانه مثل ید، دنبال می‌شود. سپس سلول‌ها را با یک ماده رنگ بر مثل الکل مجاور می‌کنند. سلول هایی که بعد از رنگ بری، رنگ قلیایی خود را حفظ کنند گرم مثبت خوانده می‌شوند و آنهایی که بی رنگ شده اند گرم منفی هستند که می توانند با رنگ دوم که از رنگ اول متفاوت است دوباره رنگ شوند.

روش کار:

١- گستره مخلوط باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی را تهیه کنید. این گستره‌ها را به کمک حرارت تثبیت کنید.

۲- گستره‌ها را به مدت ۳۰ ثانیه با کریستال ویوله رنگ کنید.

٣- گستره‌ها را با آب فشان بشویید.

۴- به گستره‌ی آماده شده ید اضافه کنید، بگذارید تا ۳۰ ثانیه مانده و اثر کند.

۵- گستره‌ها را با آب فشان بشویید.

۶- گستره‌ها را به وسیله‌ى الکل ۹۵% بی رنگ کنید. برای بی رنگ کردن یک گسترش نازک ۱۰ تا ۲۰ ثانیه کافی است، بعد از گذشت زمان مناسب، قطرات الکلی که از لام خارج می‌شود بی رنگ خواهد بود.

۷- گستره‌ها را با آب فشان بشویید.

۸- گستره‌ها را با نوشین یا سافرانین به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه رنگ کنید.

۹- گستره‌ها را با آب فشان شسته و خشک کنید.

۱۰- روی هر یک از گسترهها یک قطره روغن سدر (Immersion Oil) بریزید و آن را با عدسی با بزرگنمایی ۱۰۰ مشاهده کنید.

شکل میکروب‌ها را رسم کنید. در هر مرحله از این روش چه اتفاقی حادث می‌شود؟ اگر بعد از هر مرحله، سلول‌های گرم مثبت و گرم منفی را بررسی کنیم، می توانیم نتایجی را که در جدول ۱- خلاصه شده است ملاحظه کنیم. برای بحث درباره اساس تمایز بین باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی، همینطور برای شناختن فرضیاتی که مکانیسم واکنش گرم را تشریح می‌کنند، به یک کتاب درسی یا مقاله‌ای درباره سیتولوژی میکروبی مراجعه کنید.

روش کار:

گسترهای مخلوط از باکتری‌های گرم مثبت و منفی تهیه کرده، آن را فیکس نموده و برابر شکل رنگ آمیزی آن را کامل کنید.

١- گستره را با کریستال ویوله به مدت حدود ۳۰ ثانیه رنگ کنید.

۲- آن را با آب بشویید.

۳- گستره را با محلول پد گرم به مدت حدود ۳۰ ثانیه بپوشانید.

۴- آن را با آب بشویید.

۵- گستره را به مدت ۲۰ تا ۳۰ ثانیه با الکل ۹۵% بی رنگ کنید.

۶- گستره را با رنگ متفاوت سافرانین به مدت حدود ۲۰ ثانیه رنگ کنید.

۷- آن را با آب بشویید.

۸- گستره را خشک کنید.

مراحل رنگ آمیزی گرمشکل ۳- مراحل رنگ آمیزی گرم

جدول ۱- مراحل رنگ آمیزی گرم

مراحل رنگ آمیزی گرم

فکر کنید و پاسخ دهید:

۱- آیا می توان رنگ اولیه و رنگ دوم را تغییر داد؟

۲- اگر ید را با سایر عوامل اکسید‌کننده عوض کنید چه تغییراتی حاصل خواهد شد؟

۳- آیا الکل‌های دیگر نیز به خوبی الکل اتیلیک می توانند به عنوان عوامل رنگ بر به کار روند؟

۴- اثر pH روی واکنش گرم چیست؟

ب) رنگ آمیزی اسید فست (Acid fast stain): رنگ آمیزی اسید فست، رنگ آمیزی تشخیصی است که میزان و درجه مقاومت سلول‌های رنگ شده را در برابر رنگ بری اسیدها تعیین می‌کند. خاصیت مقاومت در برابر اسیدها در بعضی مایکوباکتریوم‌ها (Mycobacterium) و اکتینومیست‌ها (Actinomycete) بستگی به مقدار زیادی لیپید دارد که در آنها موجود است. برای رنگ آمیزی این باکتری‌ها حرارت و رنگی که دارای گرایش قوی به سلول این باکتری‌ها دارد مورد نیاز است. این باکتریها، بعد از یک بار رنگ شدن، به دشواری ممکن است بی رنگ شوند. در این روش از کربول فوشین گرم برای رنگ آمیزی، و از محلول اسید – الکل به عنوان عامل بی رنگ‌کننده استفاده و بعد هم رنگ آمیزی دوم سلول باکتریها عملی می‌شود. باکتری‌های اسید فست، کندتر از سایر میکروارگانیسم ها، در برابر اسید – الکل بی رنگ شده، بعد از رنگ آمیزی دوم، رنگ اولیه خود را حفظ می‌کنند. این رنگ آمیزی در درجه اول برای تشخیص و بررسی بیماری هایی که به وسیله‌ی میکروب‌های اسید فست، مثل سل و جذام تولید می‌شود، مورد استفاده قرار می‌گیرد. همین طور این روش به عنوان یک رنگ آمیزی تشخیصی، در مورد تعدادی از میکروب‌های ساپروفیت (Saprophyte) و بی آزار اسید فست هم بکار می‌رود.

روش کار:

۱- یک گستره میکروبی شامل مخلوطی از کشت‌های مایکوباکتریوم و اشریشیا تهیه کنید.

۲- گستره را در هوا خشک کرده، با حرارت تثبیت کنید.

۳- در حدود ۱/۵ سانتیمتر آب در یک ظرف کوچک ریخته، آن را بجوش آورید، یک صفحه سیمی‌روی لبه ظرف قرار داده، لام میکروبی را روی این صفحه بگذارید.

۴- گستره را به مدت ۵ تا ۱۰ دقیقه با کربول فوشین رنگ کنید، بدین شکل که ابتدا یک تکه کوچک کاغذ خشک کن یا پارچه حوله‌ای روی گستره گذاشته، آن را با ماده‌ی رنگی بپوشانید. توجه کنید که در حین رنگ آمیزی، نگذارید گستره خشک شود. از زیاد شدن ماده رنگی روی گستره جلوگیری کنید.

۵- نمونه را با آب بشویید. ۶- نمونه را با اسید الکل (الکل اتیلیک ۹۵% حاوی اسیدنیتریک ۲/۵%) به مدت ۱۰ تا ۳۰ ثانیه بی رنگ کنید.

۷- نمونه را با آب بشویید.

۸- رنگ آمیزی دوم را با متیلن بلو به مدت ۳۰ ثانیه انجام دهید. (بدون حرارت)

۹- نمونه را با آب شسته، با کاغذ خشک کن بدون وارد کردن فشار خشک کنید.

۱۰- نمونه را با عدسی روغنی ایمرسیون ملاحظه کرده، اشکال میکروبی را رسم کنید.

با بکار بردن روش رنگ آمیزی اسید فست، خلط یک بیمار مسلول را که در اتوکلاو قرار داده اید (به وسیله‌ی بخار و زیر فشار استریل شده است) رنگ آمیزی کنید. برای تهیه‌ی گستره میکروبی، خلط را در بین دو لام گذاشته و با فشار، یک لایه‌ی نازک میکروبی ایجاد کنید. بعد از رنگ آمیزی، به جستجوی میکروب‌های اسید فست بپردازید دقت کنید که از نظر ظاهر چه اختلافی بین آنها و سایر میکروارگانیسم‌های خلط وجود دارد. میکروارگانیسم‌های اسید فست، با اسیدا لکل بی رنگ نمی‌شوند و به رنگ قرمز دیده می‌شوند. سایر میکروب‌ها به رنگ آبی خواهند بود.

رنگ آمیزی ساختمان‌های سلولی: برای به دست آوردن تضادی که در دیدن ساختمانهای مختلف سلول باکتری‌ها به وسیله‌ی میکروسکوپ نوری ضروری است، باید روش‌های رنگ آمیزی مخصوصی را به کار برد این آزمایش بعضی از رنگ آمیزی‌های ساختمانی را نشان می‌دهد.

روش کار:

الف) رنگ آمیزی آندوسپور (Endospore): انواع جنس باسیلوس (Bacillus) و کلستریدیوم‌ها (Clostridium) در برابر عوامل نامساعد تبدیل به شکل آندوسپور خوانده می‌شود. آندوسپور برخلاف سلول جوان به وجود آورنده‌ی آن، دارای جسم بسیار مقاومی است و می تواند، به مدتی طولانی، حتی در محیطی که به دلیل درجه

حرارت بالا یا مواد شیمیایی سمی‌نامساعد شده است، زنده بماند. اندوسپور در برابر رنگ آمیزی مقاومت نشان می‌دهد و بعد از یک بار رنگ شدن هم به سختی رنگ خود را از دست داده، یا رنگ زمینه را می پذیرد. از این خاصیت برای نمایش میکروسکوپی آندوسپورها استفاده شده است. در شرایط معمولی اندوسپور باکتری‌ها با میکروسکوپ الکترونی قابل مشاهده است که تصویر آن در شکل ۴ نمایش داده شده است. دو روش رنگ آمیزی در این جا ذکر می‌شود:

۱- روش دورنر (Dorner): در روش دورنر، از کربول فوشین گرم برای نفوذ به اندوسپور مقاوم استفاده می‌شود. نیگروزین هم به عنوان عامل بی رنگ‌کننده و هم به عنوان رنگ منفی گستره بکار می‌رود. بعد از رنگ آمیزی با این روش، اندوسپورها به رنگ قرمز و قسمت‌های جوان سلولها به صورت بی رنگ در یک زمینه‌ی تیره دیده می‌شوند. مراحل رنگ آمیزی به شرح زیر است:

۱- ۵ قطره آب استریل در دو لوله‌ی آزمایش ریخته، در این دو لوله دو سوسپانسیون غلیظ از باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus) و کلستریدیوم اسپوروژنس (Cl.Sporogenes) بسازید.

۲- به دو سوسپانسیون میکروبی به مقدار مساوی کربول فوشین بیفزایید.

٣- رنگ آمیزی را به مدت ۱۰ دقیقه در حمام آب جوش انجام دهید.

۴- نمونه‌ها را با عدسی شیئی ایمرسیون مشاهده کرده، شکل آنها را بکشید.

۲- روش شافر و فولتون (Schaeffer and fulton): در روش رنگ آمیزی شافر و فولتون از رنگ گرم سبز مالاشیت (Malachite green) به عنوان رنگ قوی که بعد از شستشو از آندوسپور جدا نمی‌شود و از سافرانین به عنوان رنگ دوم استفاده می‌شود. بنابراین آندوسپور به رنگ سبز در می آید ولی بقیه سلولها (یا سلول بدون اندوسپور) به رنگ قرمز کمرنگ خواهند بود.

معمولی اندوسپور باکتری‌ها با میکروسکوپ الکترونیشکل ۴

– روش رنگ آمیزی با رنگ سبز مالاشیت:

١- گستره باسیلوس سرئوس یا کلستریدیوم اسپوروژنس را تهیه کرده، گستره‌ها را در هوا خشک کنید و آنها را با حرارت تثبیت نمایید.

۲- لامها را روی پایه‌ی مخصوص رنگ آمیزی که روی ظرف آب جوش قرار دارد بگذارید.

۳- گستره‌ها را با قطعات کوچک کاغذ خشک کن پوشانده، و با سبزمالاشیت آغشته کنید تا به صورت اشباع در آمده (محلول آبی ۵%) و حرارت دادن را به مدت ۵ دقیقه ادامه دهید.

۴- گستره‌ها را بآرامی با آب بشویید.

۵- رنگ آمیزی را به مدت ۳۰ ثانیه با سافرانین به عنوان رنگ دوم انجام دهید.

۶- گستره‌ها را با آب شسته، با خشک کن خشک کنید.

۷- گستره‌ها را با عدسی شیئی روغنی ایمرسیون مشاهده کرده، شکل آنها را بکشید. برای دیدن اندوسپور بدون رنگ آمیزی می توان از میکروسکوپ فاز کنتراست استفاده کرد که در این مورد اندوسپور به صورت یک ساختمان سفید کلفت در داخل سلول دیده می‌شود. اگر میکروسکوپ فاز کنتراست در دسترس باشد، آندوسپورهای کشت باسیلوس سرئوس و کلستریدیوم اسپوروژنس را زیر آن مشاهده کنید. (شکل ۵ حرارت دادن لام را در حین رنگ آمیزی اسپور باکتری‌ها نشان می‌دهد.)

بخار دادن به لام در حین رنگ آمیزی اسپور باکتری‌هاشکل ۵- بخار دادن به لام در حین رنگ آمیزی اسپور باکتری‌ها

ب) رنگ آمیزی دیوارهای سلولی (Cellwall) : به دلیل نازکی و مقاومت در برابر رنگ آمیزی، دیوارهای سلولی سخت باکتری‌های حقیقی را به طور طبیعی به سختی می توان از بقیه قسمت‌های سلول تشخیص داد اما این قسمت با میکروسکوپ الکترونی به راحتی قابل مشاهده است که تصویر آن در شکل ۶ نمایش داده شده است. به هر حال، با به کار بردن بعضی دندانه‌ها امکان رنگ آمیزی و دیدن این ساختمان امکان پذیر است. برای مثال، با مجاور کردن دیواره‌ی سلولی با یک عامل کاتیون سطحی، می توان آن را، دارای بار الکتریکی مثبت کرد، که بعد این ساختمان می تواند با یک رنگ اسیدی رنگ آمیزی شود، سیتوپلاسم بار الکتریکی منفی خود را حفظ کرده، می تواند به وسیله‌ی یک رنگ قلیایی متضاد رنگ آمیزی شود. نمونه‌ای را که برای نشان دادن رنگ آمیزی دیوارهای سلولی برایتان تهیه شده است به وسیله‌ی عدسی شیئی روغنی ایمرسیون میکروسکوپ نوری خود مشاهده کنید. توجه کنید که برای دیدن این رنگ آمیزی نورپردازی دقیق ضروری است.

بقیه قسمت‌های سلول تشخیص داد اما این قسمت با میکروسکوپ الکترونیشکل ۶

برای این آزمایش با استعمال ستیل پیریدینیوم کلراید (Cetyl Pyridinium chloride) دیوارهای سلولی دارای بار الکتریکی مثبت شده است، که این ماده در آب به صورت کاتیون ستیل پیریدینیوم با بار الکتریکی مثبت و یون کلرور با بار الکتریکی منفی تجزیه شده است. در نتیجه جذب کاتیون ستیل پیریدینیوم، سطح، یا دیواره، سلول باکتری دارای بار الکتریکی مثبت شده است. سپس دیواره با رنگ اسیدی کنگو (Congo) به رنگ قرمز و سیتوپلاسم با رنگ متیلن بلو (Methylene blue) به رنگ آبی رنگ آمیزی می‌شوند.

تاژک باکتری‌ها که با رنگ آمیزی مشخص گردیده است.شکل ۷- تاژک باکتری‌ها که با رنگ آمیزی مشخص گردیده است.

ج) رنگ آمیزی تاژک (Flagellum): ابعاد تاژک باکتری‌ها کمتر از حد بزرگ نمایی میکروسکوپ نوری است. بنابراین تا قبل از استفاده از میکروسکوپ الکترونی، رؤیت مستقیم این ساختمانها غیر ممکن بود، ولی به هرحال با روش‌های رنگ آمیزی مخصوص یعنی با پوشاندن سطح تاژک‌ها با یک دندانه (رسوب دادن نمکهای مختلف) و بدین طریق افزایش ابعاد قابل رؤیت آنها، می توان تاژک‌ها را در حدود درشت نمایی میکروسکوپ نوری قرار داد.

آزمایش: رنگ آمیزی تاژک باکتری‌ها

مواد مورد نیاز:

١- کشت ۲۴ – ۱۸ ساعته باسیلوس سابتیلیس (Bacillus subtilis) در محیط کشت نوترینت آگار که به صورت شیب‌دار کشت داده شده است.

٢- الکل اتیلیک ۹۵%

٣- رنگ تاژک لیفسون (Liefson’s) محلول A ،B وC

۴- محلول متیلن بلو

۵- لوله‌های آزمایش استریل

۶- محلول تمیزکننده‌ی بی کرومات

۷- لوله‌های دارای آب مقطر استریل

روش کار:

۱- ابتدا به مدت یک هفته لام‌های مورد استفاده برای رنگ آمیزی تاژک را در محلول تمیزکننده‌ی بی کرومات قرار داده، بعد از طی مدت مذکور آنها را با الکل ۹۵% شست و شو دهید و بگذارید خشک شود. (بدون پاک کردن)

سعی کنید در برداشتن لام‌های مزبور از محلول تمیز کننده، کناره‌های آنها را بگیرید تا از آلوده و کثیف شدن سطح لامها جلوگیری شود.

۲- مدت چند ثانیه لام را روی شعله‌ی چراغ الکلی به جلو و عقب حرکت دهید.

٣- بگذارید لام‌ها در هوای آزمایشگاه سرد شوند.

۴- درب لوله دارای کشت باکتری باسیلوس سابتیلیس را باز نموده، ۳-۲ میلی‌لیتر آب مقطر استریل روی سطح شیب‌دار محیط بریزید و بعد از بستن درب لوله بارامی آن را تکان دهید.

۵- با پیپت استریل یک قطره از سطح بالای محلول (جایی که باکتری‌های متحرک فراوان هستند) برداشته، در یک طرف لام نزدیک یک لبه‌ی آن قرار دهید.

۶- با کمی‌شیب دادن به لام، اجازه دهید مواد قطره قطره به سمت دیگر لام جریان یابد. (تاحدی که در سطح لام پخش شود)

۷- بدون آن که با حرارت گسترش را ثابت کنید، بگذارید تا در هوای اتاق خشک شود.

۸- محلولهای A ،B و C لیفسون را به مقدار مساوی (هرکدام ۲ میلی لیتر) با یکدیگر مخلوط نموده، به وسیله‌ی پیپت استریل، یک قطره از مخلوط فوق را روی سطح گسترش قرار دهید و بگذارید به مدت ۱۰ دقیقه باقی بماند.

۹- بعد از گذشت مدت مزبور، بدون آن که رنگ‌های اضافه را دور بریزید، لام را زیر جریان ملایم آب معمولی گرفته، شست و شو دهید.

۱۰- رنگ متیلن بلو (۱ درصد) را افزوده، بگذارید یک دقیقه باقی بماند.

۱۱- لام را زیر جریان ملایم آب معمولی شستشو داده، بگذارید تا در هوای آزمایشگاه خشک شود و سپس مورد مشاهده‌ی میکروسکوپی قرار دهید.

۱۲- تاژکها را به رنگ قرمز و سلول باکتری را به رنگ آبی خواهید دید.

د) رنگ آمیزی کپسول (Capsul): خیلی از باکتری‌ها به وسیله‌ی یک لایه‌ی صمغی با ضخامتهای مختلف احاطه شده اند که به نام کپسول خوانده شده، نسبت به سلول با شدت کمتری رنگ آمیزی می‌شوند چون اغلب اوقات کپسول‌ها به صورت یک محوطه‌ی رنگ نشده در اطراف سلول‌های رنگ شده ظاهر می‌شوند، بنابراین می توانند با مواد خارجی رنگ نشده مثل محوطه خالی حاصل از مچاله و منقبض شدن سلول ها، اشتباه شوند، بنابراین برای نشان دادن کپسول‌ها مهم ترین روش رنگ آمیزی، روش رنگ آمیزی منفی است که مراحل آن در شکل ۲-۶ مشخص شده است. با کمک رنگهای منفی، نظیر نیگروزین، می توانید نمونه هایی را برای مشخص کردن کپسول باکتریها تهیه نمایید و با بکار بردن عدسی شیئی روغنی ایمرسیون میکروسکوپ نوری مشاهده کنید.

گاهی ممکن است کپسول‌ها با مواد روشن اطراف سلول باکتری اشتباه شوند. چنان که سطح روشن اطراف سلول‌ها ممکن است نشان دهنده‌ی کپسول نباشد ولی صرف رنگ آمیزی غیر صحیح و یا کم رنگ موجب چنین اشتباهی می‌شوند. به این جهت کپسول‌ها باید به طریقی رنگ شوند که به خوبی از سلول باکتری تمیز داده شوند.

روش رنگ آمیزی کپسول باکتری ها:

مواد و لوازم مورد نیاز:

١- کشت شیب‌دار ۴۸ ساعته باکتری کلبسیلا نمونیا (Klebsiela pneumonia)

۲- محلول یک درصد کریستال ویوله

٣- محلول ۲۰% سولفات مس

روش کار:

۱- از پرگنه کلبسیلا نمونیا روی یک لام تمیز گستره تهیه نموده، بگذارید در هوای آزمایشگاه خشک شود.

۲- از حرارت دادن لام برای ثابت نمودن گستره خودداری نمایید.

کپسولهای رنگ شده در زیر میکروسکوپ معمولیشکل ۸- کپسولهای رنگ شده در زیر میکروسکوپ معمولی

٣- از محلول کریستال ویوله مقداری روی گستره ریخته، بگذارید مدت دو دقیقه باقی بماند.

۴- لام را با محلول ۲۰% سولفات مس شستشو داده، بگذارید در هوای آزمایشگاه خشک شود.

۵- لام را مورد مشاهده‌ی میکروسکوپی قرار دهید. سلول باکتری به رنگ آبی تیره و کپسول به رنگ آبی بنفش دیده میشود.

رنگ آمیزی مواد ذخیره‌ای سلول باکتری: سلول میکروب‌ها، در مراحل مختلف رشد خود دارای مواد ته نشین یا گرانول‌هایی(Granule) هستند که اغلب تصور می‌شود مواد ذخیره‌ای سلول باشند. یک منبع ساکاریدی که اغلب در سلول مخمرها و بعضی از سلول باکتریها یافت می‌شود گلیکوژن است. به نظر می آید که این ماده شبیه کربوهیدرات ذخیره‌ای سلول حیوانات باشد، زیرا با ید به رنگ قرمز مایل به قهوه‌ای در می آید. منابع لیپیدی هم که مهم ترین آنها اسید پلی – بتا – هیدروکسی بوتیریک (poly Beta hydroxybutyric acid) است، در خیلی از باکتری‌ها وجود دارد. اگرچه این مواد را نمی توان با رنگ‌های معمولی به سهولت رنگ آمیزی کرد، ولی می توان آنها را با رنگ‌های محلول در چربی نشان داد، که احتمالا بدین طریق یک لایه‌ی لیپیدی اطراف این منابع رنگ می‌شوند. یکی از بهترین انواع این رنگها سودان¬سیاه¬ب (Sudan black – B) می باشد. بعضی از منابع ذخیره‌ای باکتری‌ها را اغلب به نام ولوتین (Volutin) می خوانند که با رنگ‌های قلیایی به شدت رنگ آمیزی می‌شود. این مواد گرانول‌های پلی متا – فسفاتی (Polymetapho sphate) هستند. (تصویر گرانول‌های ذخیره‌ای که به کمک میکروسکوپ الکترونی تهیه شده در شکل ۹ به نمایش گذاشته شده است.)

روش کار: (گلیکوژن)

۱- با به کار بردن سیم مخصوص تلقیح مقداری سلول مخمر ساکارومیسس سرویسیه (Saccharomyces cerevisiae) را به یک قطره آب که روی یک لام تمیز قرار دارد انتقال داده، بآرامی آن را در آب مخلوط کنید تا یک سوسپانسیون حاصل شود.

۲- یک قطره د لوگل اضافه کرده، آنها را به آرامی‌در روی لام مخلوط کنید.

تصویر میکروسکوپ الکترونی اندوسپورشکل ۹- تصویر میکروسکوپ الکترونی اندوسپور

۳- یک لامل روی نمونه گذاشته، آن را با عدسی شیئی روغنی ایمرسیون مشاهده کنید.

برای این آزمایش، محیط کشت باید اسیدی باشد. اگر کشت قلیایی است، قبل از افزودن ید آن را اسیدی کنید، بعضی از باکتری ها، مخصوصا گروهی از باکتریهای بی هوازی اسپوردار، حاوی کربوهیدرات ذخیره‌ای دیگری به نام یوژن (Iogen) یا گرانولوز (Granulose) هستند که باید به رنگ آبی در می آید. اسید پلی – بتا – هیدروکسی بوتیریک.

١- تعدادی سلول باسیلوس مگاتریوم (Bucillus megaterium) را به یک قطره‌ی آب که در روی یک لام تمیز قرار دارد انتقال داده، مخلوط کنید.

۲- یک قطره محلول سودان سیاه ب اضافه کرده، مخلوط کنید.

۳- یک لامل روی نمونه‌ی حاصل گذاشته، آن را با عدسی شیئی روغنی ایمرسیون مشاهده کنید.

یادداشت: چون سلولها باستثنای جدار اطراف پلی – بتا- هیدروکسی بوتیریک بی رنگ هستند، از این رو برای افزایش تضاد، مقدار نور را کاهش دهید.

ولوتین

١- گستره‌ای از باسیلوس سرئوس تهیه کنید. بگذارید تا خشک شده، آن را با حرارت تثبیت کنید.

۲- یک قطره محلول آبی اسیدی شده متیلن بلو اضافه کنید.

۳- روی نمونه حاصل یک لامل گذاشته، آن را با عدسی شیئی روغنی ایمرسیون مشاهده کنید.

بیشتر محتویات سلولی، مثل پروتئین ها، با رنگهای قلیایی فقط هنگامی‌رنگ می‌شوند که pH محیط اطرافشان بالاتر از نقطه‌ی ایزوالکتریک آنها باشد. موادی که دارای نقطه‌ی ایزوالکتریک (Isoelecteric point) خیلی اسیدی هستند با یک رنگ قلیایی اسیدی شده (pH = 2-3) رنگ آمیزی می‌شوند. بنابراین، ولوتین که از مواد اسیدی تشکیل شده با یک رنگ قلیایی حتی در کمتر از pH ۴ هم رنگ می‌شود. ولوتین یک پلی فسفات است که ظاهرا در سنتز اسیدهای نوکلئیک و در تأمین انرژی سلولها وارد عمل می‌شود.

خودآزمایی

١- اثر تغییر دادن رنگ اول و دوم چیست؟ همین طور با حذف حرارت چه تغییری حاصل خواهد شد؟

۲- آیا میکروارگانیسم‌های اسید فست گرم مثبت و یا گرم منفی هستند؟

٣- مزایای رنگ آمیزی باکتری‌ها چیست؟

۴- انواع روش‌های رنگ آمیزی باکتری‌ها و رنگ‌های مورد استفاده در آنها را بنویسید.

۵- منظور از تثبیت باکتری‌ها قبل از رنگ آمیزی چیست؟ از چه عواملی برای آن استفاده می‌شود؟

۶- روش تثبیت باکتری‌ها را بنویسید.

۷- رنگ‌های قلیایی و اسیدی هریک چگونه باعث رنگ آمیزی باکتری‌ها می‌شوند؟

۸- اساس رنگ آمیزی‌های تشخیصی چیست؟

۹- به طور خلاصه رنگ آمیزی گرم را شرح دهید.

۱۰- از رنگ آمیزی اسید فست به چه منظورهایی استفاده می‌شود؟

۱۱- برای رنگ آمیزی آندوسپور باکتری‌ها از چه روش‌ها و رنگ هایی می توان استفاده کرد؟

آیا این مقاله برای شما مفید بود؟
بله
تقریبا
خیر

داریوش طاهری

اولیــــــن نیستیــم ولی امیـــــد اســــت بهتـــرین باشیـــــم...! خدایــــــــــا! نام و آوازه مــــــرا چنان در حافظــه‌ها تثبیت کن که آلزایمـــــــــر نیز تــوان به یغمـا بـردن آن را نـداشتــــــه باشـد...! خدایـــــــــا! محبّـت مــرا در دل‌های بندگانت بینداز ... خدایــــــا! مــــرا دوســــت بــــدار و محبوبــم گـــردان...!

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا