مبانی علوم اعصاب اریک کندل؛ آزادسازی انتقال‌دهنده‌؛ چرخه وزیکول سیناپسی

Transmitter Is Stored and Released by Synaptic Vesicles

ترانسمیتر توسط وزیکول‌های سیناپتیک ذخیره و آزاد می‌شود

What morphological features of the cell might account for the quantal release of transmitter? The physiological observations indicating that transmitter is released in fixed quanta coincided with the discovery, through electron microscopy, of accumulations of small clear vesicles in the presynaptic terminal. Del Castillo and Katz speculated that the vesicles were organelles for the storage of transmitter, each vesicle stored one quantum of transmitter (amounting to several thousand molecules), and each vesicle released its entire contents into the synaptic cleft in an all-or-none manner at sites specialized for release.

چه ویژگی‌های مورفولوژیکی سلول ممکن است برای آزادسازی کمی ترانسمیتر توضیح دهد؟ مشاهدات فیزیولوژیکی که نشان می‌دهد ترانسمیتر در کوانتای ثابت آزاد می‌شود، همزمان با کشف تجمع وزیکول‌های شفاف کوچک در پایانه پیش‌سیناپسی از طریق میکروسکوپ الکترونی بود. دل کاستیلو و کاتز حدس زدند که وزیکول‌ها اندامک‌هایی برای ذخیره‌سازی ترانسمیتر هستند، هر وزیکول یک کوانتوم ترانسمیتر (به تعداد چند هزار مولکول) را ذخیره می‌کند، و هر وزیکول تمام محتویات خود را در شکاف سیناپسی به شیوه‌ای همه یا هیچ در مکان‌هایی که برای رهاسازی تخصصی هستند آزاد می‌کند.

The sites of release, the active zones, contain a cloud of synaptic vesicles that cluster above a fuzzy electron-dense material attached to the internal face of the presynaptic membrane (see Figure 15-4A). At all synapses, the vesicles are typically clear, small, and ovoid, with a diameter of approximately 40 nm (in distinction with the large dense-core vesicles described in Chapter 16). Although most synaptic vesicles do not contact the active zone, some are physically bound. These are called the docked vesicles and are thought to be the ones immediately available for release (sometimes referred to as the readily releasable pool). At the neuromuscular junction, the active zones are linear structures (see Figure 15-4), whereas in central synapses, they are dis shaped structures approximately 0.1 μm^۲ in area with dense projections pointing into the cytoplasm. Active zones are generally found in precise apposition to the postsynaptic membrane patches that contain the neurotransmitter receptors (see Figure 13-2). Thus, presynaptic and postsynaptic specializations are functionally and morphologically attuned to each other, sometimes precisely aligned in structural “nanocolumns.” As we shall learn later, several key active zone proteins involved in transmitter release have now been identified and characterized.

مکان‌های رهاسازی، مناطق فعال، حاوی ابری از وزیکول‌های سیناپسی هستند که در بالای یک ماده متراکم الکترونی فازی که به وجه داخلی غشای پیش سیناپسی متصل است، خوشه می‌شوند (شکل ۱۵-4A را ببینید). در تمام سیناپس‌ها، وزیکول‌ها به طور معمول شفاف، کوچک و بیضی شکل، با قطر تقریباً ۴۰ نانومتر هستند (در تمایز با وزیکول‌های بزرگ با هسته متراکم توضیح داده شده در فصل ۱۶). اگرچه بیشتر وزیکول‌های سیناپسی با ناحیه فعال تماس ندارند، اما برخی از آنها از نظر فیزیکی محدود شده اند. این وزیکول‌ها نامیده می‌شوند و گمان می‌رود آنهایی هستند که فوراً برای رهاسازی در دسترس هستند (گاهی اوقات به عنوان حوضچه‌ای که به راحتی آزاد می‌شوند نیز نامیده می‌شوند). در محل اتصال عصبی عضلانی، نواحی فعال ساختارهای خطی هستند (شکل ۱۵-۴ را ببینید)، در حالی که در سیناپس‌های مرکزی، ساختارهایی به شکل تقریباً ۰.۱ μm^۲ با برجستگی‌های متراکم به سمت سیتوپلاسم هستند. مناطق فعال عموماً در قرارگیری دقیق با تکه‌های غشای پس سیناپسی که حاوی گیرنده‌های انتقال دهنده عصبی هستند یافت می‌شوند (شکل ۱۳-۲ را ببینید). بنابراین، تخصص‌های پیش سیناپسی و پس سیناپسی از نظر عملکردی و مورفولوژیکی با یکدیگر هماهنگ می‌شوند، گاهی اوقات دقیقاً در “نانوستون” ساختاری همسو می‌شوند. همانطور که بعداً یاد خواهیم گرفت، چندین پروتئین منطقه فعال کلیدی که در آزادسازی ترانسمیتر نقش دارند، اکنون شناسایی و مشخص شده اند.

Figure 15-6 Neurotransmitter is released in fixed increments. Each increment or quantum of transmitter produces a unit end-plate potential of fixed amplitude. The amplitude of the response evoked by nerve stimulation is thus equal to the amplitude of the unit end-plate potential multiplied by the number of quanta of transmitter released.

شکل ۱۵-۶ انتقال دهنده عصبی با افزایش‌های ثابت آزاد می‌شود. هر افزایش یا کوانتوم ترانسمیتر یک واحد پتانسیل صفحه انتهایی با دامنه ثابت تولید می‌کند. بنابراین دامنه پاسخ برانگیخته شده توسط تحریک عصبی برابر است با دامنه پتانسیل صفحه انتهایی واحد ضرب در تعداد کوانتوم‌های ترانسمیتر آزاد شده.

A. Intracellular recordings from a muscle fiber at the end-plate show the change in postsynaptic potential when eight consecutive stimuli of the same size are applied to the motor nerve. To reduce transmitter release and to keep the end-plate potentials small, the tissue is bathed in a Ca2+ deficient (and magnesiumrich) solution. The postsynaptic responses to the nerve stimulus vary. Two of the eight presynaptic stimuli elicit no EPSP (failures), two produce unit potentials, and the others produce EPSPs that are approximately two to four times the amplitude of the unit potential. Note that the spontaneous miniature end-plate potentials (S), which occur at random intervals in the traces, are the same size as the unit potential. (Adapted, with permission, from Liley 1956.)

الف. ثبت‌های درون سلولی از یک فیبر عضلانی در صفحه انتهایی، تغییر در پتانسیل پس سیناپسی را هنگامی‌که هشت محرک متوالی با همان اندازه روی عصب حرکتی اعمال می‌شود، نشان می‌دهد. برای کاهش آزادسازی ترانسمیتر و کوچک نگه داشتن پتانسیل‌های صفحه انتهایی، بافت در محلول کمبود Ca2+ (و غنی از منیزیم) غسل داده می‌شود. پاسخ‌های پس سیناپسی به محرک عصبی متفاوت است. دو تا از هشت محرک پیش سیناپسی هیچ EPSP (شکست) ایجاد نمی‌کنند، دو تا پتانسیل واحد تولید می‌کنند و بقیه EPSPهایی تولید می‌کنند که تقریباً دو تا چهار برابر دامنه پتانسیل واحد هستند. توجه داشته باشید که پتانسیل‌های مینیاتوری خود به خودی صفحه انتهایی (S) که در فواصل تصادفی در ردیابی‌ها رخ می‌دهند، به اندازه پتانسیل واحد هستند. (اقتباس شده، با اجازه، از Liley 1956.)

B. After many end-plate potentials are recorded, the number of responses with a given amplitude is plotted as a function of this amplitude in the histogram shown here. The distribution of responses falls into a number of peaks. The first peak, at 0 mV, represents failures. The first peak of responses, at 0.4 mV, represents the unit potential, the smallest elicited response. The unit response has the same amplitude as the spontaneous miniature end-plate potentials (inset), indicating that the unit response is caused by the release of a single quantum of transmitter. The other peaks in the histogram are integral multiples of the amplitude of the unit potential; that is, responses are composed of two, three, four, or more quantal events.

ب. پس از ثبت بسیاری از پتانسیل‌های صفحه انتهایی، تعداد پاسخ‌ها با دامنه معین به عنوان تابعی از این دامنه در هیستوگرام نشان داده شده در اینجا رسم می‌شود. توزیع پاسخ‌ها در چند قله قرار می‌گیرد. اولین پیک، در ۰ میلی ولت، نشان دهنده شکست است. اولین پیک پاسخ‌ها، در ۰.۴ میلی ولت، نشان دهنده پتانسیل واحد، کوچکترین پاسخ استخراج شده است. پاسخ واحد دارای همان دامنه است که پتانسیل‌های مینیاتوری خود به خودی صفحه انتهایی (در داخل)، نشان می‌دهد که پاسخ واحد در اثر آزاد شدن یک کوانتوم ترانسمیتر ایجاد می‌شود. قله‌های دیگر در هیستوگرام مضربی جدایی ناپذیر از دامنه پتانسیل واحد هستند. یعنی پاسخ‌ها از دو، سه، چهار یا چند رویداد کمی‌تشکیل شده اند.

The number of responses under each peak divided by the total number of events in the entire histogram is the probability that a single presynaptic action potential triggers the release of the number of quanta that comprise the peak. For example, if there are 30 events in the peak corresponding to the release of two quanta out of a total of 100 events recorded, the probability that a presynaptic action potential releases exactly two quanta is 30/100 or 0.3. This probability follows a Poisson distribution (red curve). This theoretical distribution is composed of the sum of several Gaussian functions. The spread of the unit peak (standard deviation of the Gaussian function) reflects the fact that the amount of transmitter in a quantum, and hence the amplitude of the quantal postsynaptic response, varies randomly about a mean value. The successive Gaussian peaks widen progressively because the variability (or variance) associated with each quantal event increases linearly with the number of quanta per event. The distribution of amplitudes of the spontaneous miniature potentials (inset) is fit by a Gaussian curve whose width is identical to that of the Gaussian curve for the unit synaptic responses. (Adapted, with permission, from Boyd and Martin 1956.)

تعداد پاسخ‌ها در زیر هر پیک تقسیم بر تعداد کل رویدادها در کل هیستوگرام، احتمال این است که یک پتانسیل عمل پیش‌سیناپسی منفرد باعث آزادسازی تعداد کوانتوم‌هایی می‌شود که پیک را تشکیل می‌دهند. به عنوان مثال، اگر ۳۰ رویداد در اوج مربوط به آزادسازی دو کوانتا از مجموع ۱۰۰ رویداد ثبت شده وجود داشته باشد، احتمال اینکه یک پتانسیل عمل پیش سیناپسی دقیقاً دو کوانتا را آزاد کند ۳۰/۱۰۰ یا ۰.۳ است. این احتمال از توزیع پواسون (منحنی قرمز) پیروی می‌کند. این توزیع نظری از مجموع چندین تابع گاوسی تشکیل شده است. گسترش پیک واحد (انحراف استاندارد تابع گاوسی) نشان دهنده این واقعیت است که مقدار ترانسمیتر در یک کوانتوم، و در نتیجه دامنه پاسخ پس سیناپسی کمی، به طور تصادفی در حدود یک مقدار متوسط ​​تغییر می‌کند. پیک‌های گاوسی متوالی به تدریج گسترش می‌یابند زیرا تغییرپذیری (یا واریانس) مرتبط با هر رویداد کمی‌به صورت خطی با تعداد کوانتوم‌ها در هر رویداد افزایش می‌یابد. توزیع دامنه‌های پتانسیل‌های مینیاتوری خود به خود (داخل) با یک منحنی گاوسی که عرض آن با منحنی گاوسی برای پاسخ‌های سیناپسی واحد یکسان است، مطابقت دارد. (اقتباس شده، با اجازه، از بوید و مارتین ۱۹۵۶.)

Box 15-1 Synaptic Strength Depends on the Probability of Transmitter Release and Other Quantal Parameters

کادر ۱۵-۱ قدرت سیناپسی به احتمال آزاد شدن ترانسمیتر و سایر پارامترهای کمی‌بستگی دارد

The mean size of a synaptic response E evoked by an action potential has often been described as the product of the total number of releasable quanta (n), the probability that an individual quantum of transmitter is released (p), and the size of the response to a quantum (a):

E = n.p.a.

اندازه متوسط ​​یک پاسخ سیناپسی E که توسط یک پتانسیل عمل برانگیخته می‌شود اغلب به عنوان حاصلضرب تعداد کل کوانتوم‌های قابل آزادسازی (n)، احتمال آزاد شدن یک کوانتوم ترانسمیتر جداگانه (p) و اندازه پاسخ به یک کوانتوم (a):

E = n.p.a.

These parameters are statistical terms, useful for describing the size and variability of the postsynaptic response. At some but not all central synapses, they can also be assigned to biological processes. We begin by focusing on synapses of the kind envisioned by Katz and colleagues, where the interpretation of the parameters is most straightforward. At these synapses, the presynaptic terminal typically contains multiple active zones, and each active zone releases at most a single vesicle in response to an action potential (univesicular release).

این پارامترها اصطلاحات آماری هستند که برای توصیف اندازه و تنوع پاسخ پس سیناپسی مفید هستند. در برخی اما نه همه سیناپس‌های مرکزی، می‌توان آنها را به فرآیندهای بیولوژیکی اختصاص داد. ما با تمرکز بر سیناپس‌هایی از نوع پیش بینی شده توسط کاتز و همکاران شروع می‌کنیم، جایی که تفسیر پارامترها بسیار ساده است. در این سیناپس‌ها، پایانه پیش‌سیناپسی معمولاً شامل چندین ناحیه فعال است و هر ناحیه فعال حداکثر یک وزیکول را در پاسخ به پتانسیل عمل آزاد می‌کند.

We then consider another kind of synapse that requires a different interpretation. At these synapses, each active zone can release multiple vesicles in response to a single action potential (multivesicular release), leading to very high concentrations of transmitter in the synaptic cleft that can cause the postsynaptic receptors to become saturated with transmitter.

سپس نوع دیگری از سیناپس را در نظر می‌گیریم که نیاز به تفسیر متفاوتی دارد. در این سیناپس‌ها، هر ناحیه فعال می‌تواند چندین وزیکول را در پاسخ به یک پتانسیل عمل واحد آزاد کند (آزادسازی چند سیکولار)، که منجر به غلظت‌های بسیار بالای ترانسمیتر در شکاف سیناپسی می‌شود که می‌تواند باعث اشباع شدن گیرنده‌های پس سیناپسی با ترانسمیتر شود.

Univesicular Release at Multiple Active Zones

آزادسازی یونیوزیکولار در نواحی فعال متعدد

In the simplest case, the parameter a is the response of the postsynaptic membrane to the release of a single vesicle’s contents of transmitter. It is assumed that transmitter is packaged in synaptic vesicles, that release of the contents of a vesicle is a stereotyped, all-or-none event, and that single release events occur in physical isolation from each other. Quantal size depends on the amount of transmitter in a vesicle and on the properties of the postsynaptic cell, such as the membrane resistance and capacitance (which can be independently estimated) and the responsiveness of the postsynaptic membrane to the transmitter substance. This can also be measured experimentally by the postsynaptic membrane’s response to the application of a known amount of transmitter.

در ساده ترین حالت، پارامتر a پاسخ غشای پس سیناپسی به آزاد شدن محتویات ترانسمیتر یک وزیکول است. فرض بر این است که ترانسمیتر در وزیکول‌های سیناپسی بسته بندی شده است، که آزادسازی محتویات یک وزیکول یک رویداد کلیشه ای، همه یا هیچ است، و اینکه رویدادهای آزادسازی منفرد در انزوای فیزیکی از یکدیگر رخ می‌دهند. اندازه کوانتال به مقدار ترانسمیتر در یک وزیکول و به خواص سلول پس سیناپسی، مانند مقاومت و ظرفیت غشاء (که می‌توان به طور مستقل تخمین زد) و پاسخ‌دهی غشای پس سیناپسی به ماده ترانسمیتر بستگی دارد. این را می‌توان به طور تجربی با پاسخ غشای پس سیناپسی به استفاده از مقدار مشخصی از ترانسمیتر اندازه گیری کرد.

The parameter n describes the maximum number of quantal units that can be released in response to a single action potential if the probability p reaches 1.0. At some central synapses, this maximum may be imposed by the number of release sites (active zones) in the terminals of a presynaptic neuron that contact a given postsynaptic neuron. Multiple studies have found that for this kind of connection n corresponds with the number of release sites determined by electron microscopy, as if those sites obeyed a rough rule wherein a presynaptic action potential triggers the exocytosis of at most one vesicle per active zone.

پارامتر n حداکثر تعداد واحدهای کمی‌را توصیف می‌کند که می‌توانند در پاسخ به یک پتانسیل عمل آزاد شوند، اگر احتمال p به ۱.۰ برسد. در برخی از سیناپس‌های مرکزی، این حداکثر ممکن است توسط تعداد مکان‌های رهاسازی (مناطق فعال) در پایانه‌های یک نورون پیش‌سیناپسی که با یک نورون پس‌سیناپسی خاص تماس دارند، تحمیل شود. مطالعات متعدد نشان داده‌اند که برای این نوع اتصال n با تعداد مکان‌های رهاسازی تعیین‌شده توسط میکروسکوپ الکترونی مطابقت دارد، گویی آن مکان‌ها از یک قانون کلی پیروی می‌کنند که در آن پتانسیل عمل پیش‌سیناپسی باعث برون‌زایی حداکثر یک وزیکول در هر منطقه فعال می‌شود.

The parameter p represents the likelihood of vesicle release. This likelihood encompasses a series of events necessary for a particular release site to contribute a quantal event: (1) The active zone must be loaded with at least one releasable vesicle (a process referred to as vesicle mobilization); (2) the presynaptic action potential must evoke Ca2 influx in sufficient quantity and proximity to the vesicle; and (3) the Ca2*sensitive synaptotagmin and SNARE machinery must cause the vesicle to fuse and discharge its contents.

پارامتر p نشان دهنده احتمال آزاد شدن وزیکول است. این احتمال شامل یک سری رویدادهای ضروری برای یک مکان آزادسازی خاص برای کمک به یک رویداد کمی‌است: (۱) منطقه فعال باید با حداقل یک وزیکول آزاد شونده بارگذاری شود (فرآیندی که به آن بسیج وزیکول گفته می‌شود). (۲) پتانسیل عمل پیش سیناپسی باید هجوم Ca2 به مقدار کافی و نزدیکی به وزیکول را برانگیزد. و (۳) ماشین آلات سیناپتوتاگمین و SNARE حساس به Ca2* باید باعث جوش خوردن وزیکول و تخلیه محتویات آن شود.

Here, we focus mainly on the determinants of p. We can treat quantal release at a single active zone as a random event with only two possible outcomes in response to an action potential-the quantum of transmitter is or is not released. Because the quantal responses from different active zones are thought to occur independently of each other in some situations, this is similar to tossing a set of n coins in the air and counting the number of heads or tails. The equivalent of individual coin flips (Bernoulli trials) are then totaled up in a binomial distribution, where p stands for the average probability of success (that is, the probability that any given quantum will be released) and q (equal to 1 p) stands for the mean probability of failure.

در اینجا، ما عمدتاً بر روی عوامل تعیین کننده p تمرکز می‌کنیم. ما می‌توانیم آزادسازی کوانتال در یک منطقه فعال را به عنوان یک رویداد تصادفی با تنها دو نتیجه ممکن در پاسخ به یک پتانسیل عمل در نظر بگیریم کوانتوم ترانسمیتر آزاد می‌شود یا نیست. از آنجایی که تصور می‌شود پاسخ‌های کمی‌از مناطق فعال مختلف در برخی موقعیت‌ها مستقل از یکدیگر رخ می‌دهند، این شبیه پرتاب کردن مجموعه‌ای از n سکه در هوا و شمارش تعداد سر یا دم است. سپس معادل تک تک چرخش‌های سکه (آزمایش‌های برنولی) در یک توزیع دوجمله‌ای جمع می‌شوند، جایی که p مخفف میانگین احتمال موفقیت (یعنی احتمال آزاد شدن هر کوانتوم معین) و q (برابر با ۱ p است). ) مخفف میانگین احتمال شکست است.

Quantal transmission has been demonstrated at all chemical synapses so far examined. Nevertheless, the efficacy of transmitter release from a single presynaptic cell onto a single postsynaptic cell varies widely in the nervous system and depends on several factors: (1) the number of individual synapses between a pair of presynaptic and postsynaptic cells (that is, the number of presynaptic boutons that contact the postsynaptic cell); (2) the number of active zones in an individual synaptic terminal; and (3) the probability that a presynaptic action potential will trigger release of one or more quanta of transmitter at an active zone. As we will see later, release probability can be powerfully regulated as a function of neuronal activity.

انتقال کوانتال در تمام سیناپس‌های شیمیایی که تاکنون مورد بررسی قرار گرفته اند، نشان داده شده است. با این وجود، کارایی آزادسازی ترانسمیتر از یک سلول پیش سیناپسی منفرد به یک سلول پس سیناپسی منفرد به طور گسترده ای در سیستم عصبی متفاوت است و به عوامل مختلفی بستگی دارد: (۱) تعداد سیناپس‌های فردی بین یک جفت سلول پیش سیناپسی و پس سیناپسی (یعنی تعداد بوتون‌های پیش سیناپسی که با سلول پس سیناپسی تماس می‌گیرند. (۲) تعداد مناطق فعال در یک پایانه سیناپسی فردی. و (۳) احتمال اینکه یک پتانسیل عمل پیش سیناپسی باعث آزاد شدن یک یا چند کوانتا ترانسمیتر در یک منطقه فعال شود. همانطور که بعدا خواهیم دید، احتمال رهاسازی را می‌توان به طور قدرتمندی به عنوان تابعی از فعالیت عصبی تنظیم کرد.

Box 15-1 Synaptic Strength Depends on the Probability of Transmitter Release and Other Quantal Parameters (continued)

کادر ۱۵-۱ قدرت سیناپسی به احتمال آزاد شدن ترانسمیتر و سایر پارامترهای کوانتال بستگی دارد (ادامه دارد)

Both the average probability (p) that an individual quantum will be released and the maximal number (n) (continued) of releasable quanta are assumed to be constant. (Any reduction in the store of vesicles is assumed to be quickly replenished after each stimulus.) The product of n and p yields an estimate m of the mean number of quanta that will be released. This mean is called the quantal content or quantal output.

هم احتمال متوسط ​​(p) که یک کوانتوم منفرد آزاد می‌شود و هم حداکثر تعداد (n) (ادامه) کوانتوم‌های قابل آزادسازی ثابت فرض می‌شوند. (هر گونه کاهش در ذخیره وزیکول‌ها پس از هر محرک به سرعت دوباره پر می‌شود.) حاصل ضرب n و p تخمینی m از میانگین تعداد کوانتوم‌هایی را که آزاد می‌شوند به دست می‌دهد. این میانگین محتوای کمی‌یا خروجی کمی‌نامیده می‌شود.

Calculation of the probability of transmitter release can be illustrated with the following example. Consider a terminal that has a releasable store of five quanta (n = 5). Assuming p=0.1, then the probability that an individual quantum will not be released from the terminals (q) is 1-p, or 0.9. We can now determine the probability that a stimulus will release no quanta (failure), a single quantum, or any other number of quanta (up to n).

محاسبه احتمال آزاد شدن ترانسمیتر را می‌توان با مثال زیر نشان داد. پایانه‌ای را در نظر بگیرید که دارای یک ذخیره‌سازی قابل رهاسازی از پنج کوانتا (n=5) است. با فرض p=0.1، احتمال اینکه یک کوانتوم منفرد از پایانه‌ها (q) آزاد نشود، ۱-p یا ۰.۹ است. اکنون می‌توانیم احتمال اینکه یک محرک هیچ کوانتومی‌(شکست)، یک کوانتوم منفرد یا هر تعداد کوانتوم دیگری (تا n) را آزاد نکند را تعیین کنیم.

The probability that none of the five available quanta will be released by a given stimulus is the product of the individual probabilities that each quantum will not be released: q^۵= (۰.۹)^۵, or 0.59. We would thus expect to see 59 failures in a hundred stimuli. The probabilities of observing zero, one, two, three, four, or five quanta are represented by the successive terms of the binomial expansion:

(q+p)^۵ = q^۵ (failures) + 5 q^۴p (1 quantum)
+10q3p2 (2 quanta)+10q2p3 (3 quanta)
+۵ qp^۴ (۴ quanta) + p^۵ (۵ quanta).

احتمال اینکه هیچ یک از پنج کوانتوم موجود توسط یک محرک مشخص آزاد نشوند حاصل ضرب احتمالات فردی است که هر کوانتوم آزاد نخواهد شد: q5= (0.9)5 یا ۰.۵۹. بنابراین انتظار داریم در صد محرک شاهد ۵۹ شکست باشیم. احتمال مشاهده کوانتوم‌های صفر، یک، دو، سه، چهار یا پنج با عبارت‌های متوالی بسط دوجمله ای نشان داده می‌شود:

(q+p)^۵ = q^۵ (failures) + 5 q^۴p (1 quantum)
+10q3p2 (2 quanta)+10q2p3 (3 quanta)
+۵ qp^۴ (۴ quanta) + p^۵ (۵ quanta).

Thus, in 100 stimuli, the binomial expansion would predict 33 single unit responses, 7 double responses, 1 triple response, and 0 quadruple or quintuple responses.

بنابراین، در ۱۰۰ محرک، بسط دو جمله ای ۳۳ پاسخ واحد، ۷ پاسخ دوگانه، ۱ پاسخ سه گانه و ۰ پاسخ چهار یا پنجگانه را پیش بینی می‌کند.

Values for the quantal output m vary from approximately 100 to 300 at the vertebrate nerve-muscle synapse, the squid giant synapse, and Aplysia central synapses, to as few as 1 to 4 in the synapses of the sympathetic ganglion and spinal cord of vertebrates. The probability of release p also varies, ranging from as high as 0.7 at the neuromuscular junction in the frog and 0.9 in the crab down to around 0.1 at some mammalian central synapses. Estimates for n range from as much as 1,000 (at the vertebrate nerve-muscle synapse) to 1 (at single terminals of mammalian central neurons).

مقادیر خروجی کمی‌m از حدود ۱۰۰ تا ۳۰۰ در سیناپس عصب-عضله مهره داران، سیناپس غول پیکر ماهی مرکب و سیناپس مرکزی Aplysia تا ۱ تا ۴ در سیناپس‌های گانگلیون سمپاتیک و نخاع مهره داران متغیر است. احتمال آزادسازی p نیز متفاوت است، از ۰.۷ در محل اتصال عصبی عضلانی در قورباغه و ۰.۹ در خرچنگ تا حدود ۰.۱ در برخی از سیناپس‌های مرکزی پستانداران متغیر است. تخمین‌ها برای n از ۱۰۰۰ (در سیناپس عصب-عضله مهره‌داران) تا ۱ (در پایانه‌های منفرد نورون‌های مرکزی پستانداران) متغیر است.

This numerical example illustrates a characteristic feature of synapses with simple binomial featurestheir substantial variability. This holds just as strongly whether p is high or low. For example, for p = 0.9 and 100 stimuli, the binomial expansion predicts 0 failures, 0 single unit responses, 1 double response, 7 triple responses, 33 quadruple responses, and 59 quintuple responses, the mirror-image of the distribution for p = 0.1. Even if each sequential event that supports vesicle release is highly likely, the aggregate strength of the synapse will vary widely.

این مثال عددی یک ویژگی مشخص از سیناپس‌ها با ویژگی‌های دو جمله‌ای ساده را نشان می‌دهد تنوع قابل‌توجه آنها. چه مقدار p زیاد باشد چه کم، این به همان اندازه صادق است. به عنوان مثال، برای p = 0.9 و ۱۰۰ محرک، بسط دو جمله ای ۰ شکست، ۰ پاسخ واحد واحد، ۱ پاسخ دوگانه، ۷ پاسخ سه گانه، ۳۳ پاسخ چهارگانه و ۵۹ پاسخ پنجگانه را پیش بینی می‌کند، تصویر آینه ای توزیع برای p = 0.1. حتی اگر هر رویداد متوالی که از آزادسازی وزیکول پشتیبانی می‌کند بسیار محتمل باشد، قدرت کل سیناپس بسیار متفاوت خواهد بود.

Multivesicular Release with Receptor Saturation

آزادسازی چند وزیکولی با اشباع گیرنده

One well-studied mechanism for achieving high synaptic reliability is through the release of multiple vesicles onto a single postsynaptic site. In the extreme, this can release sufficient amounts of transmitter in the synaptic cleft to cause the postsynaptic receptor binding sites to become fully occupied by transmitter (receptor saturation).

یک مکانیسم به خوبی مطالعه شده برای دستیابی به قابلیت اطمینان سیناپسی بالا از طریق رهاسازی وزیکول‌های متعدد در یک سایت پس سیناپسی واحد است. در نهایت، این می‌تواند مقادیر کافی ترانسمیتر را در شکاف سیناپسی آزاد کند تا باعث شود که مکان‌های اتصال گیرنده پس سیناپسی به طور کامل توسط ترانسمیتر اشغال شود (اشباع گیرنده).

Under these conditions, the postsynaptic response will reach a maximal amplitude. Further release of transmitter, for example in response to a modulatory neurotransmitter, would fail to increase the postsynaptic response. Variability in response size would shrink greatly if, say, three to five vesicles worth of transmitter activated the same number of receptors as a single vesicle. The postsynaptic response would be highly stereotyped (it would appear to result from release of a single quantum of transmitter) even though the presynaptic terminal was releasing multiple vesicles. However, the binomial treatment could still retain some usefulness as a way of adding up the contributions of multiple synapses of this kind, so long as each synapse released transmitter simultaneously and independently. But in such a case, n, p, and a would take on biological meanings different from those in which only a single vesicle could be released per synapse.

در این شرایط، پاسخ پس سیناپسی به حداکثر دامنه خواهد رسید. آزادسازی بیشتر ترانسمیتر، برای مثال در پاسخ به یک انتقال دهنده عصبی تعدیلی، نمی‌تواند پاسخ پس سیناپسی را افزایش دهد. اگر مثلاً سه تا پنج وزیکول ترانسمیتر همان تعداد گیرنده را به عنوان یک وزیکول فعال کند، تنوع در اندازه پاسخ به شدت کاهش می‌یابد. پاسخ پس سیناپسی بسیار کلیشه ای خواهد بود (به نظر می‌رسد که از آزادسازی یک کوانتوم ترانسمیتر منفرد ناشی می‌شود) حتی اگر پایانه پیش سیناپسی وزیکول‌های متعددی را آزاد کند. با این حال، تا زمانی که هر سیناپس ترانسمیتر را به طور همزمان و مستقل آزاد کند، درمان دوجمله‌ای همچنان می‌تواند به عنوان راهی برای جمع کردن مشارکت‌های سیناپس‌های متعدد از این نوع مفید باشد. اما در چنین حالتی، n، p و a معانی بیولوژیکی متفاوت از آنهایی که در آن تنها یک وزیکول منفرد در هر سیناپس آزاد می‌شود، به خود می‌گیرند.

In the central nervous system, most presynaptic boutons have only a single active zone where an action potential usually releases at most a single quantum of transmitter in an all-or-none manner. However, at some central synapses, such as the calyx of Held, transmitter is released from a large presynaptic terminal that may contain many active zones and thus can release a large number of quanta in response to a single presynaptic action potential. Central neurons also vary in the number of synapses that a typical presynaptic cell forms with a typical postsynaptic cell. Whereas most central neurons form only a few synapses with any one postsynaptic cell, a single climbing fiber from neurons in the inferior olive forms up to 10,000 terminals on a single Purkinje neuron in the cerebellum! Finally, the mean probability of transmitter release from a single active zone also varies widely among presynaptic terminals, from less than 0.1 (that is, a 10% chance that a presynaptic action potential will trigger release of a vesicle) to greater than 0.9. This wide range of probabilities can even be seen among the boutons at individual synapses between a specific type of presynaptic cell and a specific type of postsynaptic cell.

در سیستم عصبی مرکزی، بیشتر بوتون‌های پیش سیناپسی تنها یک ناحیه فعال دارند که در آن پتانسیل عمل معمولا حداکثر یک کوانتوم ترانسمیتر را به صورت همه یا هیچ آزاد می‌کند. با این حال، در برخی از سیناپس‌های مرکزی، مانند کاسه گل هلد، ترانسمیتر از یک پایانه پیش‌سیناپسی بزرگ آزاد می‌شود که ممکن است دارای مناطق فعال زیادی باشد و بنابراین می‌تواند تعداد زیادی کوانتوم را در پاسخ به یک پتانسیل عمل پیش‌سیناپسی آزاد کند. نورون‌های مرکزی نیز در تعداد سیناپس‌هایی که یک سلول پیش سیناپسی معمولی با یک سلول پس سیناپسی معمولی تشکیل می‌دهد، متفاوت است. در حالی که اکثر نورون‌های مرکزی تنها چند سیناپس را با هر سلول پس سیناپسی تشکیل می‌دهند، یک فیبر بالارونده از نورون‌های زیتون تحتانی تا ۱۰۰۰۰ پایانه روی یک نورون پورکنژ در مخچه تشکیل می‌دهد! در نهایت، میانگین احتمال آزاد شدن ترانسمیتر از یک منطقه فعال منفرد نیز در بین پایانه‌های پیش سیناپسی به طور گسترده ای متفاوت است، از کمتر از ۰.۱ (یعنی احتمال ۱۰٪ که پتانسیل عمل پیش سیناپسی باعث آزاد شدن وزیکول شود) تا بیش از ۰.۹. این دامنه وسیع از احتمالات را می‌توان حتی در بین بوتون‌های سیناپس‌های فردی بین یک نوع خاص از سلول پیش سیناپسی و یک نوع خاص از سلول پس سیناپسی مشاهده کرد.

Thus, central neurons vary widely in the efficacy and reliability of synaptic transmission. Synaptic reliability is defined as the probability that an action potential in a presynaptic cell leads to some measurable response in the postsynaptic cell-that is, the probability that a presynaptic action potential will release one or more quanta of transmitter. Efficacy refers to the mean amplitude of the synaptic response, which depends on both the reliability of synaptic transmission and on the mean size of the response when synaptic transmission does occur.

بنابراین، نورون‌های مرکزی به طور گسترده ای در اثربخشی و قابلیت اطمینان انتقال سیناپسی متفاوت هستند. قابلیت اطمینان سیناپسی به عنوان احتمالی تعریف می‌شود که یک پتانسیل عمل در یک سلول پیش سیناپسی منجر به پاسخ قابل اندازه گیری در سلول پس سیناپسی شود، یعنی احتمال اینکه یک پتانسیل عمل پیش سیناپسی یک یا چند کوانتا ترانسمیتر را آزاد کند. کارایی به دامنه متوسط ​​پاسخ سیناپسی اشاره دارد که هم به قابلیت اطمینان انتقال سیناپسی و هم به میانگین اندازه پاسخ در زمانی که انتقال سیناپسی رخ می‌دهد بستگی دارد.

Most central neurons communicate at synapses that have a low probability of transmitter release. The high failure rate of release at most central synapses (that is, their low release probability) is not a design defect but serves a purpose. As we discuss later, this feature allows transmitter release to be regulated over a wide dynamic range, which is important for adapting neural signaling to different behavioral demands. In synaptic connections where a low probability of release is deleterious for function, this limitation can be overcome by simply having many active zones in one synapse, as is the case at the calyx of Held and the nerve-muscle synapse. Both contain hundreds of independent active zones, so an action potential reliably releases 150 to 250 quanta, ensuring that a presynaptic signal is always followed by a postsynaptic action potential. Reliable transmission at the neuromuscular junction is essential for survival. An animal would not survive if its ability to move away from a predator was hampered by a low-probability response. Another strategy for increasing reliability is to use multivesicular release, the simultaneous fusion of multiple vesicles at a single active zone, to ensure that postsynaptic receptors are consistently exposed to a saturating concentration of neurotransmitter (see Box 15-1).

بیشتر نورون‌های مرکزی در سیناپس‌هایی با هم ارتباط برقرار می‌کنند که احتمال آزادسازی ترانسمیتر کم است. نرخ شکست بالای رهاسازی در اکثر سیناپس‌های مرکزی (یعنی احتمال رهاسازی کم آنها) یک نقص طراحی نیست، بلکه هدفی را دنبال می‌کند. همانطور که بعداً بحث خواهیم کرد، این ویژگی اجازه می‌دهد تا رهاسازی ترانسمیتر در یک محدوده دینامیکی گسترده تنظیم شود، که برای تطبیق سیگنال‌های عصبی با نیازهای رفتاری مختلف مهم است. در اتصالات سیناپسی که احتمال کم رهاسازی برای عملکرد مضر است، این محدودیت را می‌توان به سادگی با داشتن مناطق فعال زیاد در یک سیناپس برطرف کرد، همانطور که در کاسه گل هلد و سیناپس عصب-عضله وجود دارد. هر دو شامل صدها ناحیه فعال مستقل هستند، بنابراین یک پتانسیل عمل به طور قابل اعتماد ۱۵۰ تا ۲۵۰ کوانتا را آزاد می‌کند، و تضمین می‌کند که یک سیگنال پیش سیناپسی همیشه با یک پتانسیل عمل پس سیناپسی دنبال می‌شود. انتقال قابل اعتماد در محل اتصال عصبی عضلانی برای بقا ضروری است. اگر یک حیوان با احتمال کم توانایی خود را برای دور شدن از شکارچی مختل کند، زنده نمی‌ماند. استراتژی دیگر برای افزایش قابلیت اطمینان، استفاده از رهاسازی چند وزیکولی، ادغام همزمان وزیکول‌های متعدد در یک منطقه فعال است، تا اطمینان حاصل شود که گیرنده‌های پس سیناپسی به طور مداوم در معرض غلظت اشباع کننده انتقال دهنده عصبی قرار دارند (به کادر ۱-۱۵ مراجعه کنید).

Not all chemical signaling between neurons depends on the synaptic machinery described earlier. Some substances, such as certain lipid metabolites and the gas nitric oxide (Chapter 14), can diffuse across the lipid bilayer of the membrane. Others can be moved out of nerve endings by carrier proteins if their intracellular concentration is sufficiently high. Plasma membrane transporters for glutamate or GABA normally take up transmitter into a cell from the synaptic cleft following a presynaptic action potential (Chapter 13). However, in some glial cells of the retina, the direction of glutamate transport can be reversed under certain conditions, causing glutamate to leave the cell through the transporter into the synaptic cleft. Still other substances simply leak out of nerve terminals at a low rate. Surprisingly, approximately 90% of the ACh that leaves the presynaptic terminals at the neuromuscular junction does so through continuous leakage. This leakage is ineffective, however, because it is diffuse and not targeted to receptors at the end-plate region and because it is continuous and low level rather than synchronous and concentrated.

همه سیگنال‌های شیمیایی بین نورون‌ها به دستگاه سیناپسی که قبلاً توضیح داده شد بستگی ندارد. برخی از مواد، مانند متابولیت‌های لیپیدی خاص و گاز نیتریک اکسید (فصل ۱۴)، می‌توانند در دو لایه لیپیدی غشاء پخش شوند. اگر غلظت درون سلولی آنها به اندازه کافی زیاد باشد، می‌توان برخی دیگر را با پروتئین‌های حامل از انتهای عصبی خارج کرد. انتقال دهنده‌های غشای پلاسمایی برای گلوتامات یا گابا معمولاً ترانسمیتر را از شکاف سیناپسی به دنبال پتانسیل عمل پیش سیناپسی به داخل سلول می‌گیرند (فصل ۱۳). با این حال، در برخی از سلول‌های گلیال شبکیه، جهت انتقال گلوتامات می‌تواند تحت شرایط خاصی معکوس شود و باعث می‌شود گلوتامات از سلول از طریق ناقل به داخل شکاف سیناپسی خارج شود. سایر مواد به سادگی از پایانه‌های عصبی با سرعت کم نشت می‌کنند. با کمال تعجب، تقریباً ۹۰ درصد از ACh که از پایانه‌های پیش سیناپسی در محل اتصال عصبی عضلانی خارج می‌شود، این کار را از طریق نشت مداوم انجام می‌دهد. با این حال، این نشتی بی‌اثر است، زیرا منتشر است و گیرنده‌های ناحیه انتهای صفحه را هدف قرار نمی‌دهد و به دلیل اینکه پیوسته و سطح پایین است نه همزمان و متمرکز.

Synaptic Vesicles Discharge Transmitter by Exocytosis and Are Recycled by Endocytosis

انتقال دهنده تخلیه وزیکول‌های سیناپسی توسط اگزوسیتوز و توسط اندوسیتوز بازیافت می‌شوند

The quantal hypothesis of del Castillo and Katz has been amply confirmed by direct experimental evidence that synaptic vesicles do indeed package neurotransmitter and that they release their contents by directly fusing with the presynaptic membrane, a process termed exocytosis.

فرضیه کمی‌دل کاستیلو و کاتز با شواهد تجربی مستقیم به طور کامل تایید شده است که وزیکول‌های سیناپسی در واقع انتقال دهنده‌های عصبی را بسته بندی می‌کنند و محتوای خود را با ترکیب مستقیم با غشای پیش سیناپسی آزاد می‌کنند، فرآیندی که اگزوسیتوز نامیده می‌شود.

Forty years ago, Victor Whittaker discovered that the synaptic vesicles in the motor nerve terminals of the electric organ of the electric fish Torpedo contain a high concentration of ACh. Later, Thomas Reese and John Heuser and their colleagues obtained electron micrographs that caught vesicles in the act of exocytosis. To observe the brief exocytotic event, they rapidly froze the nerve-muscle synapse by immersing it in liquid helium at precisely defined intervals after the presynaptic nerve was stimulated. In addition, they increased the number of quanta of transmitter discharged with each nerve impulse by applying the drug 4-aminopyridine, a compound that blocks certain voltage-gated K+ channels, thus increasing the duration of the action potential and enhancing Ca2+ influx. (The spike broadening produced by this pharmacological intervention resembles spike broadening resulting from cumulative inactivation of K+ channels during repetitive firing; see Figure 15-15C.) In both cases, prolonged action potentials evoke greater opening of presynaptic Ca channels.

چهل سال پیش، ویکتور ویتاکر کشف کرد که وزیکول‌های سیناپسی در پایانه‌های عصبی حرکتی اندام الکتریکی ماهی الکتریکی اژدر حاوی غلظت بالایی از ACh است. بعدها، توماس ریس و جان هوسر و همکارانشان میکروگراف‌های الکترونی به دست آوردند که وزیکول‌ها را در حین اگزوسیتوز می‌گرفتند. برای مشاهده رویداد اگزوسیتوز کوتاه، آنها به سرعت سیناپس عصب-عضله را با غوطه ور کردن آن در هلیوم مایع در فواصل زمانی دقیق پس از تحریک عصب پیش سیناپسی منجمد کردند. علاوه بر این، آنها تعداد کوانتومای ترانسمیتر تخلیه شده با هر تکانه عصبی را با استفاده از داروی ۴-aminopyridine افزایش دادند، ترکیبی که کانال‌های خاص K+ دارای ولتاژ را مسدود می‌کند، بنابراین مدت زمان پتانسیل عمل را افزایش داد و هجوم Ca2+ را افزایش داد. (گسترش سنبله تولید شده توسط این مداخله دارویی شبیه گسترش سنبله ناشی از غیرفعال شدن تجمعی کانال‌های K+ در طی شلیک مکرر است؛ شکل ۱۵-15C را ببینید.) در هر دو مورد، پتانسیل‌های طولانی مدت عمل باعث باز شدن بیشتر کانال‌های کلسیم پیش سیناپسی می‌شود.

These techniques provided clear images of synaptic vesicles at the active zone during exocytosis. Using a technique called freeze-fracture electron microscopy, Reese and Heuser noted deformations of the presynaptic membrane along the active zone immediately after synaptic activity, which they interpreted as invaginations of the cell membrane caused by fusion of synaptic vesicles. These deformations lay along one or two rows of unusually large intramembranous particles, visible along both margins of the presynaptic density. Many of these particles are now thought to be voltage-gated Ca2+ channels (Figure 15-7). The particle density (approximately 1,500 per μm2) is similar to the Ca2+ channel density that is thought to be present in the presynaptic plasma membrane at the active zone. Moreover, the proximity of the particles to the release site is consistent with the short time interval between the onset of the Ca2+ current and the release of transmitter.

این تکنیک‌ها تصاویر واضحی از وزیکول‌های سیناپسی در ناحیه فعال در طول اگزوسیتوز ارائه می‌دهند. ریس و هوسر با استفاده از تکنیکی به نام میکروسکوپ الکترونی شکستگی انجماد، تغییر شکل‌های غشای پیش سیناپسی را در امتداد منطقه فعال بلافاصله پس از فعالیت سیناپسی، که آنها به‌عنوان فرورفتگی غشای سلولی ناشی از همجوشی وزیکول‌های سیناپسی تعبیر کردند، یادداشت کردند. این تغییر شکل‌ها در امتداد یک یا دو ردیف از ذرات درون غشایی غیرمعمول بزرگ قرار دارند که در امتداد هر دو حاشیه چگالی پیش سیناپسی قابل مشاهده هستند. اکنون تصور می‌شود که بسیاری از این ذرات کانال‌های +Ca2 دارای ولتاژ هستند (شکل ۱۵-۷). چگالی ذرات (تقریباً ۱۵۰۰ در هر μm2) مشابه چگالی کانال +Ca2 است که تصور می‌شود در غشای پلاسمایی پیش سیناپسی در ناحیه فعال وجود دارد. علاوه بر این، نزدیکی ذرات به محل رهاسازی با فاصله زمانی کوتاه بین شروع جریان +Ca2 و آزادسازی ترانسمیتر مطابقت دارد.

Finally, Heuser and Reese found that these deformations are transient; they occur only when vesicles are discharged and do not persist after transmitter has been released. Thin-section electron micrographs revealed a number of omega-shaped (2) structures with the appearance of synaptic vesicles that have just fused with the membrane, prior to the complete collapse of the vesicle membrane into the plasma membrane (Figure 15-7B). Heuser and Reese confirmed this idea by showing that the number of Q-shaped structures is directly correlated with the size of the EPSP when they varied the concentration of 4-aminopyridine to alter the amount of transmitter release. These morphological studies provide striking evidence that transmitter is released from synaptic vesicles by means of exocytosis.

در نهایت، هوسر و ریس دریافتند که این تغییر شکل‌ها گذرا هستند. آنها فقط زمانی رخ می‌دهند که وزیکول‌ها تخلیه شوند و پس از رها شدن ترانسمیتر باقی نمی‌مانند. میکروگراف‌های الکترونی با مقطع نازک تعدادی ساختار امگا شکل (۲) را با ظاهر وزیکول‌های سیناپسی نشان دادند که به تازگی با غشاء ذوب شده اند، قبل از فروپاشی کامل غشای وزیکول به غشای پلاسمایی (شکل ۱۵-7B). هوسر و ریس این ایده را با نشان دادن اینکه تعداد ساختارهای Q شکل مستقیماً با اندازه EPSP در ارتباط است، زمانی که غلظت ۴-aminopyridine را تغییر دادند تا میزان آزادسازی ترانسمیتر را تغییر دادند، تأیید کردند. این مطالعات مورفولوژیکی شواهد قابل توجهی ارائه می‌دهد که ترانسمیتر از وزیکول‌های سیناپسی با استفاده از اگزوسیتوز آزاد می‌شود.

Following exocytosis, the excess membrane added to the presynaptic terminal is retrieved. In images of presynaptic terminals made 10 to 20 seconds after stimulation, Heuser and Reese observed new structures at the plasma membrane, the coated pits, which are formed by the protein clathrin that helps mediate membrane retrieval through the process of endocytosis (Figure 15-7C). Several seconds later, the coated pits are seen to pinch off from the membrane and appear as coated vesicles in the cytoplasm. As we will see later, endocytosis through coated pit formation represents one of several means of vesicle membrane retrieval.

به دنبال اگزوسیتوز، غشای اضافی اضافه شده به پایانه پیش سیناپسی بازیابی می‌شود. در تصاویر پایانه‌های پیش سیناپسی که ۱۰ تا ۲۰ ثانیه پس از تحریک ساخته شده اند، هوسر و ریس ساختارهای جدیدی را در غشای پلاسمایی مشاهده کردند، حفره‌های پوشش داده شده، که توسط پروتئین کلاترین تشکیل شده اند که به واسطه بازیابی غشاء از طریق فرآیند اندوسیتوز کمک می‌کند (شکل ۱۵-7C). چند ثانیه بعد، گودال‌های پوشش داده شده از غشاء جدا شده و به صورت وزیکول‌های پوشیده شده در سیتوپلاسم ظاهر می‌شوند. همانطور که بعداً خواهیم دید، اندوسیتوز از طریق تشکیل گودال پوشش داده شده یکی از چندین روش بازیابی غشای وزیکول است.

Capacitance Measurements Provide Insight Into the Kinetics of Exocytosis and Endocytosis

اندازه‌گیری‌های ظرفیت بینشی در مورد سینتیک اگزوسیتوز و اندوسیتوز ارائه می‌دهند.

In certain neurons with large presynaptic terminals, the increase in surface area of the plasma membrane during exocytosis can be detected in electrical measurements as increases in membrane capacitance. As we saw in Chapter 9, the capacitance of the membrane is proportional to its surface area. Erwin Neher discovered that one could use measurements of capacitance to monitor exocytosis in secretory cells.

در نورون‌های خاصی با پایانه‌های پیش سیناپسی بزرگ، افزایش سطح غشای پلاسمایی در طول اگزوسیتوز را می‌توان در اندازه گیری‌های الکتریکی با افزایش ظرفیت غشاء تشخیص داد. همانطور که در فصل ۹ دیدیم، ظرفیت غشا متناسب با سطح آن است. اروین نهر کشف کرد که می‌توان از اندازه گیری ظرفیت برای نظارت بر اگزوسیتوز در سلول‌های ترشحی استفاده کرد.

In adrenal chromaffin cells (which release epinephrine and norepinephrine) and in mast cells of the rat peritoneum (which release histamine and serotonin), individual dense-core vesicles are large enough to permit measurement of the increase in capacitance associated with fusion of a single vesicle. Release of transmitter in these cells is accompanied by stepwise increases in capacitance, followed somewhat later by stepwise decreases, which reflect the retrieval and recycling of the excess membrane (Figure 15-8).

در سلول‌های کرومافین آدرنال (که اپی نفرین و نوراپی نفرین آزاد می‌کنند) و در ماست سل‌های صفاق موش (که هیستامین و سروتونین آزاد می‌کنند)، وزیکول‌های منفرد هسته متراکم به اندازه کافی بزرگ هستند تا امکان اندازه گیری افزایش ظرفیت مرتبط با همجوشی یک وزیکول را فراهم کنند. . رها شدن ترانسمیتر در این سلول‌ها با افزایش تدریجی ظرفیت و به دنبال آن کاهش تدریجی همراه است که بازیابی و بازیافت غشای اضافی را نشان می‌دهد (شکل ۱۵-۸).

In neurons, the changes in capacitance caused by fusion of single, small synaptic vesicles are usually too small to resolve. In certain favorable synaptic preparations that release large numbers of vesicles (such as the giant presynaptic terminals of bipolar neurons in the retina), membrane depolarization triggers a transient smooth rise and fall in the total capacitance of the terminal as a result of the exocytosis and retrieval of the membrane from hundreds of individual synaptic vesicles (Figure 15-8C). These results provide direct measurements of the rates of membrane fusion and retrieval.

در نورون‌ها، تغییرات ظرفیت خازنی ناشی از ادغام وزیکول‌های سیناپسی منفرد و کوچک معمولاً برای حل کردن بسیار کوچک است. در برخی از آماده‌سازی‌های سیناپسی مطلوب که تعداد زیادی وزیکول آزاد می‌کنند (مانند پایانه‌های پیش‌سیناپسی غول‌پیکر نورون‌های دوقطبی در شبکیه)، دپلاریزاسیون غشایی باعث افزایش و کاهش گذرا صاف در ظرفیت کل پایانه در نتیجه اگزوسیتوز و بازیابی می‌شود. غشا از صدها وزیکول سیناپسی منفرد (شکل ۱۵-8C). این نتایج اندازه گیری مستقیمی‌از سرعت همجوشی و بازیابی غشا را فراهم می‌کند.

Exocytosis Involves the Formation of a Temporary Fusion Pore

اگزوسیتوز شامل تشکیل یک منفذ همجوشی موقت است

Morphological studies of mast cells using rapid freezing suggest that exocytosis depends on the formation of a temporary fusion pore that spans the membranes of the vesicle and plasma membranes. In electrophysiological studies of capacitance increases in mast cells, a channellike fusion pore was detected in the electrophysiological recordings prior to complete fusion of vesicles and cell membranes. This fusion pore starts out with a singlechannel conductance of approximately 200 PS, similar to that of gap-junction channels, which also bridge two membranes. During exocytosis, the pore rapidly dilates, probably from around 5 to 50 nm in diameter, and the conductance increases dramatically (Figure 15-9A).

مطالعات مورفولوژیکی ماست سل‌ها با استفاده از انجماد سریع نشان می‌دهد که اگزوسیتوز به تشکیل منافذ همجوشی موقتی بستگی دارد که غشای وزیکول و غشای پلاسما را می‌پوشاند. در مطالعات الکتروفیزیولوژیکی افزایش ظرفیت در ماست سل‌ها، یک منفذ همجوشی کانال مانند در ثبت‌های الکتروفیزیولوژیک قبل از ادغام کامل وزیکول‌ها و غشای سلولی شناسایی شد. این منفذ همجوشی با رسانایی تک کانالی تقریباً ۲۰۰ PS شروع می‌شود، شبیه به کانال‌های اتصال شکاف، که دو غشاء را نیز پل می‌کنند. در طول اگزوسیتوز، منافذ به سرعت گشاد می‌شود، احتمالاً از حدود ۵ تا ۵۰ نانومتر قطر، و رسانایی به طور چشمگیری افزایش می‌یابد (شکل ۱۵-9A).

The fusion pore is not just an intermediate structure leading to exocytosis of transmitter, as transmitter can be released through the pore prior to pore expansion and vesicle collapse. This was first shown by amperometry, a method that uses an extracellular carbon-fiber electrode to detect certain amine neurotransmitters, such as serotonin, based on an electrochemical reaction between the transmitter and the electrode that generates an electrical current proportional to the local transmitter concentration. Firing of an action potential in serotonergic cells leads to a large transient increase in electrode current, corresponding to the exocytosis of the contents of a single dense-core vesicle. In some instances, these large transient increases are preceded by smaller, longerlasting current signals that reflect leakage of transmitter through a fusion pore that flickers open and closed several times prior to complete fusion (Figure 15-9B).

منافذ همجوشی فقط یک ساختار میانی نیست که منجر به اگزوسیتوز ترانسمیتر می‌شود، زیرا ترانسمیتر می‌تواند قبل از انبساط منافذ و فروپاشی وزیکول از طریق منافذ آزاد شود. این برای اولین بار توسط آمپرومتری نشان داده شد، روشی که از یک الکترود فیبر کربن خارج سلولی برای شناسایی برخی انتقال دهنده‌های عصبی آمین مانند سروتونین استفاده می‌کند، بر اساس یک واکنش الکتروشیمیایی بین ترانسمیتر و الکترود که یک جریان الکتریکی متناسب با غلظت ترانسمیتر محلی ایجاد می‌کند. شلیک پتانسیل عمل در سلول‌های سروتونرژیک منجر به افزایش گذرا بزرگ در جریان الکترود می‌شود که مربوط به اگزوسیتوز محتویات یک وزیکول با هسته متراکم است. در برخی موارد، این افزایش‌های گذرا بزرگ با سیگنال‌های جریان کوچک‌تر و بادوام‌تری همراه هستند که نشت ترانسمیتر را از طریق یک منفذ همجوشی منعکس می‌کنند که چندین بار قبل از همجوشی کامل باز و بسته می‌شود (شکل ۱۵-9B).

Figure 15-7 Synaptic vesicles release transmitter by exocytosis and are retrieved by endocytosis. The images on the left are freeze-fracture electron micrographs at a neuromuscular junction. The freeze-fracture technique exposes the intramembranous area to view by splitting the membrane along the hydrophobic interior of the lipid bilayer. The views shown are of the cytoplasmic leaflet of the bilayer presynaptic membrane looking up from the synaptic cleft (see Figure 15-4A). Conventional thin-section electron micrographs on the right show cross-section views of the presynaptic terminal, synaptic cleft, and postsynaptic muscle membrane. (Reproduced, with permission, from Heuser and Reese 1981. Permission conveyed through Copyright Clearance Center, Inc.)

شکل ۱۵-۷ وزیکول‌های سیناپسی ترانسمیتر را با اگزوسیتوز آزاد می‌کنند و توسط اندوسیتوز بازیابی می‌شوند. تصاویر سمت چپ میکروگراف‌های الکترونی شکستگی انجماد در یک اتصال عصبی عضلانی هستند. تکنیک شکستگی انجماد، ناحیه داخل غشایی را با شکافتن غشاء در امتداد قسمت داخلی آبگریز دولایه لیپیدی در معرض دید قرار می‌دهد. نماهای نشان داده شده مربوط به برگچه سیتوپلاسمی‌غشای پیش سیناپسی دولایه است که از شکاف سیناپسی به بالا نگاه می‌کند (شکل ۱۵-4A را ببینید). میکروگراف‌های الکترونی با مقطع نازک معمولی در سمت راست نماهای مقطعی از پایانه پیش سیناپسی، شکاف سیناپسی و غشای عضلانی پس سیناپسی را نشان می‌دهند. (تکثیر شده، با اجازه، از Heuser و Reese 1981. اجازه از طریق حق چاپ Clearance Center، Inc.)

A. Parallel rows of intramembranous particles arrayed on either side of an active zone are thought to be the voltage-gated Ca2+ channels essential for transmitter release (see Figure 15-4A). The thin-section image at right shows the synaptic vesicles adjacent to the active zone.

الف. ردیف‌های موازی ذرات درون غشایی که در دو طرف یک منطقه فعال قرار گرفته اند، تصور می‌شود که کانال‌های Ca2+ دارای ولتاژ هستند که برای رهاسازی ترانسمیتر ضروری هستند (شکل ۱۵-4A را ببینید). تصویر مقطع نازک سمت راست وزیکول‌های سیناپسی را در مجاورت ناحیه فعال نشان می‌دهد.

B. Synaptic vesicles release transmitter by fusing with the plasma membrane (exocytosis). Here, synaptic vesicles are caught in the act of fusing with the plasma membrane by rapid freezing of the tissue within 5 ms after a depolarizing stimulus. Each depression in the plasma membrane represents the fusion of one synaptic vesicle. In the micrograph at right, fused vesicles are seen as Q-shaped structures.

ب) وزیکول‌های سیناپسی با ترکیب شدن با غشای پلاسمایی، ترانسمیتر را آزاد می‌کنند (اگزوسیتوز). در اینجا، وزیکول‌های سیناپسی با انجماد سریع بافت در عرض ۵ میلی‌ثانیه پس از یک محرک دپلاریزه‌کننده، در حال جوش خوردن با غشای پلاسمایی می‌شوند. هر فرورفتگی در غشای پلاسمایی نشان دهنده ادغام یک وزیکول سیناپسی است. در میکروگراف سمت راست، وزیکول‌های ذوب شده به صورت ساختارهای Q دیده می‌شوند.

C. After exocytosis, synaptic vesicle membrane is retrieved by endocytosis. Within approximately 10 seconds after fusion of the vesicles with the presynaptic membrane, coated pits form. After another 10 seconds, the coated pits begin to pinch off by endocytosis to form coated vesicles. These vesicles store the membrane proteins of the original synaptic vesicle and also molecules captured from the extracellular medium. The vesicles are recycled at the terminals or are transported to the cell body, where the membrane constituents are degraded or recycled (see Chapter 7).

جپس از اگزوسیتوز، غشای وزیکول سیناپسی توسط اندوسیتوز بازیابی می‌شود. در عرض تقریباً ۱۰ ثانیه پس از ادغام وزیکول‌ها با غشای پیش سیناپسی، حفره‌های پوشیده شده تشکیل می‌شوند. پس از ۱۰ ثانیه دیگر، حفره‌های پوشش داده شده در اثر اندوسیتوز شروع به نیشگون گرفتن می‌کنند و وزیکول‌های پوشش داده شده را تشکیل می‌دهند. این وزیکول‌ها پروتئین‌های غشایی وزیکول سیناپسی اصلی و همچنین مولکول‌های گرفته شده از محیط خارج سلولی را ذخیره می‌کنند. وزیکول‌ها در پایانه‌ها بازیافت می‌شوند یا به بدن سلولی منتقل می‌شوند، جایی که اجزای غشایی تجزیه یا بازیافت می‌شوند (به فصل ۷ مراجعه کنید).

It is possible that transmitter can also be released solely through transient fusion pores that fleetingly connect vesicle lumen and extracellular space without full collapse of the vesicle membrane into the plasma membrane. Capacitance measurements for exocytosis of large dense-core vesicles in neuroendocrine cells show that the fusion pore can open and close rapidly and reversibly. The reversible opening and closing of a fusion pore represents a very rapid method of membrane retrieval. The circumstances under which the small clear vesicles at fast synapses discharge transmitter through a fusion pore, as opposed to full membrane collapse, are uncertain.

این امکان وجود دارد که ترانسمیتر تنها از طریق منافذ همجوشی گذرا که به طور گذرا لومن وزیکول و فضای خارج سلولی را بدون فروپاشی کامل غشای وزیکول به غشای پلاسمایی متصل می‌کنند، آزاد شود. اندازه گیری ظرفیت برای اگزوسیتوز وزیکول‌های بزرگ با هسته متراکم در سلول‌های عصبی غدد درون ریز نشان می‌دهد که منافذ همجوشی می‌تواند به سرعت و برگشت پذیر باز و بسته شود. باز و بسته شدن برگشت پذیر یک منفذ همجوشی نشان دهنده یک روش بسیار سریع برای بازیابی غشاء است. شرایطی که تحت آن وزیکول‌های شفاف کوچک در سیناپس‌های سریع، ترانسمیتر را از طریق منافذ همجوشی تخلیه می‌کنند، برخلاف فروپاشی کامل غشاء، نامشخص هستند.

The Synaptic vesicle Cycle Involves Several Steps

چرخه وزیکول سیناپسی شامل چندین مرحله است

When firing at high frequency, a typical presynaptic neuron is able to maintain a high rate of transmitter release. This can result in the exocytosis of a large number of vesicles over time, more than the number morphologically evident within the presynaptic terminal. To prevent the supply of vesicles from being rapidly depleted during fast synaptic transmission, used vesicles are rapidly retrieved and recycled. Because nerve terminals are usually some distance from the cell body, replenishing vesicles by synthesis in the cell body and transport to the terminals would be too slow to be practical at fast synapses.

هنگامی‌که با فرکانس بالا شلیک می‌شود، یک نورون پیش سیناپسی معمولی قادر به حفظ نرخ بالای آزاد شدن ترانسمیتر است. این می‌تواند منجر به اگزوسیتوز تعداد زیادی از وزیکول‌ها در طول زمان شود، که بیشتر از تعداد مشخصی از نظر مورفولوژیکی در پایانه پیش سیناپسی است. برای جلوگیری از تخلیه سریع ذخایر وزیکول‌ها در طول انتقال سریع سیناپسی، وزیکول‌های استفاده شده به سرعت بازیابی و بازیافت می‌شوند. از آنجایی که پایانه‌های عصبی معمولاً تا حدودی از بدن سلولی فاصله دارند، پر کردن وزیکول‌ها از طریق سنتز در بدن سلولی و انتقال به پایانه‌ها برای سیناپس‌های سریع بسیار کند است.

Figure 15-8 (Opposite) Changes in capacitance reveal the time course of exocytosis and endocytosis.

شکل ۱۵-۸ (مقابل) تغییرات در ظرفیت، دوره زمانی اگزوسیتوز و اندوسیتوز را نشان می‌دهد.

A. Electron micrographs show a mast cell before (left) and after (right) exocytosis. Mast cells are secretory cells of the immune system that contain large dense-core vesicles filled with the transmitters histamine and serotonin. Exocytosis of the secretory vesicles is normally triggered by the binding of antigen complexed to an immunoglobulin (IgE). Under experimental conditions, massive exocytosis can be triggered by the inclusion of a nonhydrolyzable analog of guanosine triphosphate (GTP) in an intracellular recording electrode. (Reproduced, with permission, from Lawson et al. 1977. Permission conveyed through Copyright Clearance Center, Inc.)

الف. میکروگراف‌های الکترونی یک ماست سل را قبل از اگزوسیتوز (چپ) و بعد از (راست) نشان می‌دهند. ماست سل‌ها سلول‌های ترشحی سیستم ایمنی هستند که حاوی وزیکول‌های بزرگ با هسته متراکم پر از ترانسمیتر‌های هیستامین و سروتونین هستند. اگزوسیتوز وزیکول‌های ترشحی معمولاً با اتصال آنتی ژن کمپلکس شده به ایمونوگلوبولین (IgE) ایجاد می‌شود. تحت شرایط تجربی، اگزوسیتوز عظیم را می‌توان با گنجاندن یک آنالوگ غیر قابل هیدرولیز گوانوزین تری فسفات (GTP) در یک الکترود ثبت داخل سلولی ایجاد کرد. (تکثیر شده، با اجازه، از لاوسون و همکاران در سال ۱۹۷۷. مجوز از طریق مرکز پاکسازی حق چاپ، Inc.)

B. Stepwise increases in capacitance reflect the successive fusion of individual secretory vesicles with the mast cell membrane. The step increases are unequal because of variability in the membrane area of the vesicles. After exocytosis, the membrane added through fusion is retrieved through endocytosis. Endocytosis of individual vesicles gives rise to the stepwise decreases in membrane capacitance. In this way, the cell maintains a constant size. (Units are femtofarads, where 1 fF= 0.1 μm2 of membrane area.) (Adapted, with permission, from Fernandez, Neher, and Gomperts 1984.)

ب. افزایش گام به گام در ظرفیت منعکس کننده ادغام متوالی وزیکول‌های ترشحی منفرد با غشای ماست سل است. افزایش پله‌ها به دلیل تنوع در ناحیه غشای وزیکول‌ها نابرابر است. پس از اگزوسیتوز، غشاء اضافه شده از طریق همجوشی از طریق اندوسیتوز بازیابی می‌شود. اندوسیتوز وزیکول‌های منفرد باعث کاهش تدریجی ظرفیت غشا می‌شود. به این ترتیب سلول اندازه ثابتی را حفظ می‌کند. (واحدها فمتوفاراد هستند، جایی که ۱ fF= 0.1 میکرومتر مربع از سطح غشاء است.) (اقتباس شده، با اجازه، از Fernandez، Neher، و Gomperts 1984.)

C. The giant presynaptic terminals of bipolar neurons in the retina are more than 5 μm in diameter, permitting direct patch-clamp recordings of membrane capacitance and Ca2+ current. A brief depolarizing voltage-clamp step in membrane potential (V_m) elicits a large sustained Ca2+ current (I_ca) and a rise in the cytoplasmic Ca2+ concentration, [Ca]. This results in the fusion of several thousand small synaptic vesicles with the cell membrane, leading to an increase in total membrane capacitance. The increments in capacitance caused by fusion of individual vesicles are too small to resolve. As the internal Ca2+ concentration falls back to its resting level upon repolarization, the extra membrane area is retrieved and capacitance returns to its baseline value. The increases in capacitance and Ca2+ concentration outlast the brief depolarization and Ca2+ current (note different time scales) because of the relative slowness of endocytosis and Ca2+ metabolism. (Micrograph reproduced, with permission, from Zenisek et al. 2004. Copyright © ۲۰۰۴ Society for Neuroscience.)

ج. پایانه‌های غول پیکر پیش سیناپسی نورون‌های دوقطبی در شبکیه بیش از ۵ میکرومتر قطر دارند که امکان ثبت مستقیم خازن غشایی و جریان Ca2+ را می‌دهد. یک مرحله گیره ولتاژ دپلاریزاسیون مختصر در پتانسیل غشایی (Vm) باعث ایجاد جریان پایدار Ca2+ (Ica) و افزایش غلظت Ca2+ سیتوپلاسمی، [Ca] می‌شود. این منجر به ادغام چندین هزار وزیکول سیناپسی کوچک با غشای سلولی می‌شود که منجر به افزایش ظرفیت کل غشاء می‌شود. افزایش ظرفیت ناشی از همجوشی وزیکول‌های منفرد برای رفع شدن بسیار کوچک است. از آنجایی که غلظت Ca2+ داخلی پس از پلاریزاسیون مجدد به سطح استراحت خود باز می‌گردد، ناحیه اضافی غشاء بازیابی می‌شود و ظرفیت خازنی به مقدار پایه خود باز می‌گردد. افزایش ظرفیت خازنی و غلظت Ca2+ به دلیل کندی نسبی اندوسیتوز و متابولیسم Ca2+ از دپلاریزاسیون مختصر و جریان Ca2+ (به مقیاس‌های زمانی مختلف توجه کنید) بیشتر است. (میکروگراف تکثیر شده، با اجازه، از Zenisek و همکاران. ۲۰۰۴. حق چاپ © ۲۰۰۴ Society for Neuroscience.)

Synaptic vesicles are released and reused in a simple cycle. Vesicles fill with neurotransmitter and cluster in the nerve terminal. They then dock at the active zone where they undergo a complex priming process that makes vesicles competent to respond to the Ca2+ signal that triggers the fusion process (Figure 15-10A). Numerous mechanisms exist for retrieving the synaptic vesicle membrane following exocytosis, each with a distinct time course (Figure 15-10B).

وزیکول‌های سیناپسی در یک چرخه ساده آزاد می‌شوند و دوباره مورد استفاده قرار می‌گیرند. وزیکول‌ها با انتقال دهنده عصبی پر شده و در پایانه عصبی جمع می‌شوند. سپس در ناحیه فعالی که تحت یک فرآیند پرایمینگ پیچیده قرار می‌گیرند، وزیکول‌ها را قادر می‌سازد تا به سیگنال Ca2+ که فرآیند همجوشی را آغاز می‌کند، پاسخ دهند (شکل ۱۵-10A). مکانیسم‌های متعددی برای بازیابی غشای وزیکول سیناپسی به دنبال اگزوسیتوز وجود دارد که هر کدام یک دوره زمانی مشخص دارند (شکل ۱۵-10B).

The first, most rapid mechanism involves the reversible opening and closing of the fusion pore, without the full fusion of the vesicle membrane with the plasma membrane. In the kiss-and-stay pathway, the vesicle remains at the active zone after the fusion pore closes, ready for a second release event. In the kiss-andrun pathway, the vesicle leaves the active zone after the fusion pore closes, but is competent for rapid rerelease. These pathways are thought to be used preferentially during stimulation at low frequencies.

اولین و سریع ترین مکانیسم شامل باز و بسته شدن برگشت پذیر منافذ همجوشی، بدون همجوشی کامل غشای وزیکول با غشای پلاسمایی است. در مسیر بوسه و ماندن، وزیکول پس از بسته شدن منافذ همجوشی در ناحیه فعال باقی می‌ماند و برای رویداد آزادسازی دوم آماده است. در مسیر بوسه و دویدن، وزیکول پس از بسته شدن منافذ همجوشی منطقه فعال را ترک می‌کند، اما برای آزادسازی مجدد سریع مناسب است. تصور می‌شود که این مسیرها ترجیحاً در هنگام تحریک در فرکانس‌های پایین مورد استفاده قرار گیرند.

Jorgensen and colleagues have described a second pathway of ultrafast clathrin-independent endocytosis that is 200 times faster than the classical clathrin-mediated pathway. Beginning just 50 ms after exocytosis, ultrafast endocytosis occurs just outside of the active zone.

یورگنسن و همکارانش مسیر دوم اندوسیتوز مستقل از کلاترین فوق سریع را توصیف کرده اند که ۲۰۰ برابر سریعتر از مسیر کلاسیک با واسطه کلاترین است. با شروع فقط ۵۰ میلی ثانیه پس از اگزوسیتوز، اندوسیتوز فوق سریع درست خارج از منطقه فعال رخ می‌دهد.

Stimulation at higher frequencies recruits a third, slower recycling pathway that uses clathrin to retrieve the vesicle membrane after fusion with the plasma membrane. Clathrin forms a lattice-like structure that surrounds the membrane during endocytosis, giving rise to the appearance of a coat around the coated pits observed by Heuser and Reese. In this pathway, the retrieved vesicular membrane must be recycled through an endosomal compartment before the vesicles can be reused. Clathrin-mediated recycling requires up to a minute for completion and also appears to shift from the active zone to the membrane surrounding the active zone (see Figure 15-7). A fourth mechanism operates after prolonged high-frequency stimulation. Under these conditions, large membranous invaginations into the presynaptic terminal are visible, which are thought to reflect membrane recycling through a process called bulk retrieval.

تحریک در فرکانس‌های بالاتر، سومین مسیر بازیافت آهسته‌تری را ایجاد می‌کند که از کلاترین برای بازیابی غشای وزیکول پس از ادغام با غشای پلاسمایی استفاده می‌کند. کلاترین یک ساختار شبکه مانند را تشکیل می‌دهد که غشاء را در طول اندوسیتوز احاطه می‌کند و ظاهر پوششی را در اطراف حفره‌های پوشش داده شده توسط هوسر و ریس ایجاد می‌کند. در این مسیر، غشای وزیکولی بازیابی شده باید از طریق یک محفظه آندوزومی‌بازیافت شود تا وزیکول‌ها بتوانند دوباره مورد استفاده قرار گیرند. بازیافت با واسطه کلاترین تا یک دقیقه برای تکمیل نیاز دارد و همچنین به نظر می‌رسد که از منطقه فعال به غشای اطراف منطقه فعال تغییر می‌کند (شکل ۱۵-۷ را ببینید). مکانیسم چهارم پس از تحریک طولانی مدت با فرکانس بالا عمل می‌کند. تحت این شرایط، نفوذهای غشایی بزرگ در پایانه پیش سیناپسی قابل مشاهده است، که تصور می‌شود بازیافت غشاء را از طریق فرآیندی به نام بازیابی فله منعکس می‌کند.

Figure 15-9 Reversible opening and closing of fusion pores.

شکل ۱۵-۹ باز و بسته شدن برگشت پذیر منافذ همجوشی.

A. A whole cell patch clamp is used to record membrane current associated with the opening of a fusion pore. As a vesicle fuses with the plasma membrane, the capacitance of the vesicle (C_g) is initially connected to the capacitance of the rest of the cell membrane (C_m) through the high resistance of the fusion pore (r_p). Because the membrane potential of the vesicle (lumenal side negative) is normally much more negative than the membrane potential of the cell, charge flows from the vesicle to the cell membrane during fusion. This transient current (I) is associated with the increase in membrane capacitance (C_m). The magnitude of the conductance of the fusion pore (g_p) can be calculated from the time constant of the transient current according to t = C_gr_p C_g/g_p. The pore diameter can be calculated from the pore conductance, assuming that the pore spans two lipid bilayers and is filled with a solution whose resistivity is equal to that of the cytoplasm. The plot on the right shows the pore has an initial conductance of approximately 200 PS, similar to the conductance of a gap-junction channel, corresponding to a pore diameter of approximately 2 nm. The pore diameter and conductance rapidly increase as the pore dilates to approximately 7 to 8 nm in 10 ms (filled circles). (Reproduced, with permission, from Monck and Fernandez 1992. Permission conveyed through Copyright Clearance Center, Inc; and adapted, with per mission, from Spruce et al. 1990.)

الف. یک گیره وصله سلول کامل برای ثبت جریان غشاء مرتبط با باز شدن منافذ همجوشی استفاده می‌شود. هنگامی‌که یک وزیکول با غشای پلاسما ترکیب می‌شود، ظرفیت وزیکول (Cg) در ابتدا از طریق مقاومت بالای منافذ همجوشی (rp) به ظرفیت باقیمانده غشای سلولی (Cm) متصل می‌شود. از آنجایی که پتانسیل غشایی وزیکول (سمت لومنال منفی) معمولاً بسیار منفی‌تر از پتانسیل غشایی سلول است، در طی همجوشی بار از وزیکول به غشای سلولی جریان می‌یابد. این جریان گذرا (I) با افزایش ظرفیت غشا (Cm) همراه است. بزرگی رسانایی منفذ همجوشی (gp) را می‌توان از ثابت زمانی جریان گذرا با توجه به t = Cgrp Cg/gp محاسبه کرد. قطر منافذ را می‌توان از روی رسانایی منافذ محاسبه کرد، با این فرض که منافذ دو لایه لیپیدی را در بر می‌گیرد و با محلولی که مقاومت آن برابر با مقاومت سیتوپلاسم است پر شده است. نمودار سمت راست نشان می‌دهد که منفذ دارای رسانایی اولیه تقریباً ۲۰۰ PS است، مشابه رسانایی یک کانال اتصال شکاف، که مربوط به قطر منافذ تقریباً ۲ نانومتر است. قطر منافذ و رسانایی به سرعت افزایش می‌یابد زیرا منافذ گشاد می‌شود تا حدوداً ۷ تا ۸ نانومتر در ۱۰ میلی‌ثانیه (دایره‌های پر) گشاد شود. (تکثیر شده، با اجازه، از Monck and Fernandez 1992. مجوز از طریق Copyright Clearance Center, Inc، و اقتباس، با هر مأموریت، از Spruce و همکاران، ۱۹۹۰.)

B. Transmitter release is measured by amperometry. A cell is voltage-clamped with a whole cell patch electrode while an extracellular carbon fiber is pressed against the cell surface. A large voltage applied to the tip of the carbon electrode oxidizes certain amine transmitters (such as serotonin or norepinephrine). This oxidation of one molecule generates one or more free electrons, which results in an electrical current that is proportional to the amount of transmitter release. The current can be recorded through an amplifier (A_۲) connected to the carbon electrode. Membrane current and capacitance are recorded through the patch electrode amplifier (A_۱). Recordings of serotonin release (top traces) and capacitance measurements (bottom traces) from mast cell secretory vesicles are shown at the right. The records indicate that serotonin may be released through the reversible opening and closing of the fusion pore prior to full fusion (traces on left). During these brief openings, small amounts of transmitter escape through the pore, resulting in a low-level signal (a foot) that precedes a large spike of transmitter release upon full fusion. During the foot, the cell surface area (proportional to membrane capacitance) undergoes reversible step-like changes as the fusion pore opens and closes. Sometimes the reversible opening and closing of the fusion pore are not followed by full fusion (traces on right). (Adapted, with permission, from Neher 1993.)

ب. آزادسازی ترانسمیتر با آمپرومتری اندازه گیری می‌شود. یک سلول با ولتاژ با یک الکترود پچ سلول کامل بسته می‌شود در حالی که یک فیبر کربن خارج سلولی بر روی سطح سلول فشرده می‌شود. ولتاژ زیادی که به نوک الکترود کربن اعمال می‌شود، ترانسمیتر‌های آمین خاصی (مانند سروتونین یا نوراپی نفرین) را اکسید می‌کند. این اکسیداسیون یک مولکول یک یا چند الکترون آزاد تولید می‌کند که منجر به جریان الکتریکی متناسب با مقدار آزاد شدن ترانسمیتر می‌شود. جریان را می‌توان از طریق تقویت کننده (A2) متصل به الکترود کربن ثبت کرد. جریان و ظرفیت غشا از طریق تقویت کننده الکترود پچ (A1) ثبت می‌شود. ثبت‌های آزادسازی سروتونین (ردهای بالا) و اندازه‌گیری‌های ظرفیت (ردپای پایین) از وزیکول‌های ترشحی ماست سل در سمت راست نشان داده شده‌اند. سوابق نشان می‌دهد که سروتونین ممکن است از طریق باز و بسته شدن برگشت پذیر منافذ همجوشی قبل از همجوشی کامل آزاد شود (اثر در سمت چپ). در طی این بازه‌های کوتاه، مقادیر کمی‌ترانسمیتر از منافذ خارج می‌شود و در نتیجه سیگنالی در سطح پایین (یک فوت) ایجاد می‌شود که قبل از یک سنبله بزرگ از ترانسمیتر آزاد می‌شود. در طول پا، سطح سلول (متناسب با ظرفیت غشایی) با باز و بسته شدن منافذ همجوشی دچار تغییرات پله‌مانند برگشت‌پذیر می‌شود. گاهی اوقات باز و بسته شدن برگشت پذیر منافذ همجوشی با همجوشی کامل (آثار در سمت راست) همراه نیست. (اقتباس شده، با اجازه، از Neher 1993.)

Figure 15-10 The synaptic vesicle cycle.

شکل ۱۵-۱۰ چرخه وزیکول سیناپسی.

A. Synaptic vesicles are filled with neurotransmitters by active transport (step 1) and join the vesicle cluster that may represent a reserve pool (step 2). Filled vesicles dock at the active zone (step 3) where they undergo an ATP-dependent priming reaction (step 4) that makes them competent for Ca2+-triggered fusion (step 5). After discharging their contents, synaptic vesicles are recycled through one of several routes (see part B). In one common route, vesicle membrane is retrieved via clathrinmediated endocytosis (step 6) and recycled directly (step 7) or via endosomes (step 8).

الف. وزیکول‌های سیناپسی با انتقال فعال (مرحله ۱) با انتقال دهنده‌های عصبی پر می‌شوند و به خوشه وزیکول می‌پیوندند که ممکن است یک مخزن ذخیره را نشان دهد (مرحله ۲). وزیکول‌های پر شده در ناحیه فعال (مرحله ۳) قرار می‌گیرند، جایی که تحت یک واکنش پرایمینگ وابسته به ATP (مرحله ۴) قرار می‌گیرند که آن‌ها را برای همجوشی تحریک‌شده با Ca2+ توانمند می‌سازد (مرحله ۵). پس از تخلیه محتویات آنها، وزیکول‌های سیناپسی از طریق یکی از چندین مسیر بازیافت می‌شوند (بخش B را ببینید). در یک مسیر رایج، غشای وزیکول از طریق اندوسیتوز با واسطه کلاترین (مرحله ۶) بازیابی می‌شود و مستقیماً (مرحله ۷) یا از طریق آندوزوم‌ها (مرحله ۸) بازیافت می‌شود.

B. Retrieval of vesicles after transmitter discharge is thought to occur via three mechanisms, each with distinct kinetics. 1. A reversible fusion pore is the most rapid mechanism for reusing vesicles. The vesicle membrane does not completely fuse with the plasma membrane, and transmitter is released through the fusion pore. Vesicle retrieval requires only the closure of the fusion pore and thus can occur rapidly, in tens to hundreds of milliseconds. This pathway may predominate at lower to normal release rates. The spent vesicle may either remain at the membrane (kiss-and-stay) or relocate from the membrane to the reserve pool of vesicles (kiss-and-run). 2. In the classical pathway, excess membrane is retrieved through endocytosis by means of clathrin-coated pits. These pits are found throughout the axon terminal except at the active zones. This pathway may be important at normal to high rates of release. 3. In the bulk retrieval pathway, excess membrane reenters the terminal by budding from uncoated pits. These uncoated cisternae are formed primarily at the active zones. This pathway may be used only after high rates of release and not during the usual functioning of the synapse. (Adapted, with permission, from Schweizer, Betz, and Augustine 1995; Südhof 2004.)

ب. تصور می‌شود که بازیابی وزیکول‌ها پس از تخلیه ترانسمیتر از طریق سه مکانیسم انجام می‌شود که هر کدام دارای سینتیک مشخص هستند. ۱. منافذ همجوشی برگشت پذیر سریع ترین مکانیسم برای استفاده مجدد از وزیکول‌ها است. غشای وزیکول به طور کامل با غشای پلاسمایی ترکیب نمی‌شود و ترانسمیتر از طریق منافذ همجوشی آزاد می‌شود. بازیابی وزیکول فقط به بسته شدن منافذ همجوشی نیاز دارد و بنابراین می‌تواند به سرعت، در ده‌ها تا صدها میلی ثانیه اتفاق بیفتد. این مسیر ممکن است در نرخ‌های آزادسازی کمتر تا معمولی غالب شود. وزیکول مصرف شده ممکن است یا در غشاء باقی بماند (بوس و بمان) یا از غشاء به مخزن ذخیره وزیکول‌ها منتقل شود (بوس و فرار کن). ۲. در مسیر کلاسیک، غشای اضافی از طریق اندوسیتوز با استفاده از حفره‌های پوشیده شده با کلاترین بازیابی می‌شود. این حفره‌ها در سرتاسر انتهای آکسون به جز در مناطق فعال یافت می‌شوند. این مسیر ممکن است در نرخ آزادسازی نرمال تا بالا مهم باشد. ۳. در مسیر بازیابی حجیم، غشای اضافی با جوانه زدن از چاله‌های بدون پوشش دوباره وارد ترمینال می‌شود. این سیسترن‌های بدون پوشش عمدتاً در مناطق فعال تشکیل می‌شوند. این مسیر ممکن است فقط پس از سرعت بالای آزادسازی و نه در طول عملکرد معمول سیناپس استفاده شود. (اقتباس شده، با اجازه، از شوایزر، بتز، و آگوستین ۱۹۹۵؛ سودهف ۲۰۰۴.)