علوم اعصاب پروس؛ رهاسازی انتقال‌دهنده‌ها از وزیکول‌های سیناپسی و نقش کلسیم

Release of Transmitters from Synaptic Vesicles

The discovery of the quantal release of packets of neurotransmitter immediately raised the question of how such quanta are formed and discharged into the synaptic cleft. At about the time Katz and his colleagues were using physiological methods to discover quantal release of neurotransmitter, electron microscopy revealed, for the first time, the presence of synaptic vesicles in presynaptic terminals. Putting these two discoveries together, Katz and others proposed that synaptic vesicles loaded with transmitter are the source of the quanta. Subsequent biochemical studies confirmed that synaptic vesicles are the repositories of transmitters. These studies have shown that ACh is highly concentrated in the synaptic vesicles of motor neurons, where it is present at a concentration of about 100 mM. Given the diameter of a small clear-core synaptic vesicle (~50 nm), approximately 10,000 molecules of neurotransmitter are contained in a single vesicle. This number corresponds quite nicely to the amount of ACh that must be applied to a neuromuscular junction to mimic a MEPP, providing further support for the idea that quanta arise from discharge of the contents of single synaptic vesicles.

آزادسازی انتقال‌دهنده‌ها از وزیکول‌های سیناپسی

کشف آزادسازی کوانتالی بسته‌های انتقال‌دهنده عصبی بلافاصله این سوال را مطرح کرد که چگونه چنین کوانتایی تشکیل و به شکاف سیناپسی تخلیه می‌شود. تقریباً در زمانی که کاتز و همکارانش از روش‌های فیزیولوژیکی برای کشف آزادسازی کوانتالی انتقال‌دهنده عصبی استفاده می‌کردند، میکروسکوپ الکترونی برای اولین بار وجود وزیکول‌های سیناپسی را در پایانه‌های پیش‌سیناپسی آشکار کرد. کاتز و دیگران با کنار هم قرار دادن این دو کشف، پیشنهاد کردند که وزیکول‌های سیناپسی پر از انتقال‌دهنده، منبع کوانتایی هستند. مطالعات بیوشیمیایی بعدی تأیید کردند که وزیکول‌های سیناپسی مخازن انتقال‌دهنده‌ها هستند. این مطالعات نشان داده‌اند که استیل‌کولین در وزیکول‌های سیناپسی نورون‌های حرکتی بسیار متمرکز است، جایی که غلظت آن حدود 100 میلی‌مولار است. با توجه به قطر یک وزیکول سیناپسی کوچک با هسته شفاف (حدود ۵۰ نانومتر)، تقریباً ۱۰۰۰۰ مولکول انتقال‌دهنده عصبی در یک وزیکول واحد وجود دارد. این عدد به خوبی با مقدار استیل‌کولینی که باید به یک اتصال عصبی-عضلانی اعمال شود تا یک MEPP را تقلید کند، مطابقت دارد و این ایده را که کوانتوم‌ها از تخلیه محتویات وزیکول‌های سیناپسی واحد ناشی می‌شوند، بیشتر تأیید می‌کند.

To prove that quanta are caused by the fusion of individual synaptic vesicles with the plasma membrane, it is necessary to show that each fused vesicle produces a single quantal event in the postsynaptic cell. This challenge was met in the late 1970s, when John Heuser, Tom Reese, and colleagues correlated measurements of vesicle fusion with the quantal content of EPPs at the neuromuscular junction (Figure 5.7A). They used electron microscopy to determine the number of vesicles that fused with the presynaptic plasma membrane at the active zones of presynaptic terminals (Figure 5.7B). By treating terminals with different concentrations of a drug (4-aminopyridine, or 4-AP) that enhances the number of quanta released by single action potentials, it was possible to vary the amount of quantal release, determined from parallel electrical measurements of the quantal content of the EPPs. A comparison of the number of synaptic vesicle fusions observed with the electron microscope and the number of quanta released at the synapse showed a good correlation between these two measures (Figure 5.7C). These results remain one of the strongest lines of support for the idea that a quantum of transmitter release is due to fusion of a single synaptic vesicle with the presynaptic membrane. Subsequent evidence, based on other means of measuring vesicle fusion, has left no doubt about the validity of this interpretation, thereby establishing that chemical synaptic transmission results from the discharge of neurotransmitters from synaptic vesicles.

برای اثبات اینکه کوانتوم‌ها در اثر ادغام وزیکول‌های سیناپسی منفرد با غشای پلاسما ایجاد می‌شوند، لازم است نشان داده شود که هر وزیکول ادغام‌شده یک رویداد کوانتوم واحد در سلول پس‌سیناپسی ایجاد می‌کند. این چالش در اواخر دهه 1970 مطرح شد، زمانی که جان هویزر، تام ریس و همکارانشان اندازه‌گیری‌های ادغام وزیکول‌ها را با محتوای کوانتوم EPPها در محل اتصال عصبی-عضلانی مرتبط کردند (شکل 5.7A). آنها از میکروسکوپ الکترونی برای تعیین تعداد وزیکول‌هایی که با غشای پلاسمایی پیش‌سیناپسی در مناطق فعال پایانه‌های پیش‌سیناپسی ادغام شدند استفاده کردند (شکل 5.7B). با تیمار پایانه‌ها با غلظت‌های مختلف یک دارو (4-آمینوپیریدین یا 4-AP) که تعداد کوانتوم‌های آزاد شده توسط پتانسیل‌های عمل واحد را افزایش می‌دهد، تغییر مقدار آزادسازی کوانتوم، که از اندازه‌گیری‌های الکتریکی موازی محتوای کوانتوم EPPها تعیین می‌شود، امکان‌پذیر بود. مقایسه تعداد ادغام وزیکول‌های سیناپسی مشاهده شده با میکروسکوپ الکترونی و تعداد کوانتوم‌های آزاد شده در سیناپس، همبستگی خوبی را بین این دو معیار نشان داد (شکل 5.7C). این نتایج همچنان یکی از قوی‌ترین خطوط حمایتی برای این ایده است که یک کوانتوم از آزادسازی فرستنده به دلیل ادغام یک وزیکول سیناپسی واحد با غشای پیش‌سیناپسی است. شواهد بعدی، بر اساس سایر روش‌های اندازه‌گیری ادغام وزیکول، هیچ شکی در مورد اعتبار این تفسیر باقی نگذاشته است و بدین ترتیب ثابت می‌کند که انتقال سیناپسی شیمیایی ناشی از تخلیه انتقال‌دهنده‌های عصبی از وزیکول‌های سیناپسی است.

FIGURE 5.7 Relationship between synaptic vesicle exocytosis and quantal transmitter release. (A) Electron micrograph of a frog neuromuscular synapse. This synapse includes a presynaptic motor neuron that innervates a postsynaptic muscle cell and is covered by a type of glial cell called a Schwann cell. The active zone of the presynaptic terminal is the site of synaptic vesicle exocytosis. (B) Top: Active zone of an unstimulated presynaptic terminal. While many synaptic vesicles are present, including several that are docked at the active zone (arrows), none are fusing with the presynaptic plasma membrane. Bottom: Active zone of a terminal stimulated by an action potential; stimulation causes fusion (arrows) of synaptic vesicles with the presynaptic membrane. (C) Comparison of the number of observed vesicle fusion events with the number of quanta released by a presynaptic action potential. Transmitter release was varied by using different concentrations of a drug (4-AP) that affects the duration of the presynaptic action potential, thus changing the amount of calcium that enters during the action potential. The diagonal line is the 1:1 relationship expected if each vesicle that opened released a single quantum of transmitter. (C after Heuser et al., 1979; A and B courtesy of J. Heuser.).

شکل ۵.۷ رابطه بین اگزوسیتوز وزیکول سیناپسی و آزادسازی فرستنده کوانتومی. (الف) تصویر میکروسکوپ الکترونی از سیناپس عصبی-عضلانی قورباغه. این سیناپس شامل یک نورون حرکتی پیش‌سیناپسی است که یک سلول عضلانی پس‌سیناپسی را عصب‌دهی می‌کند و توسط نوعی سلول گلیال به نام سلول شوان پوشیده شده است. ناحیه فعال ترمینال پیش‌سیناپسی محل اگزوسیتوز وزیکول سیناپسی است. (ب) بالا: ناحیه فعال یک ترمینال پیش‌سیناپسی تحریک نشده. در حالی که بسیاری از وزیکول‌های سیناپسی وجود دارند، از جمله چندین وزیکول که در ناحیه فعال متصل شده‌اند (فلش‌ها)، هیچ‌کدام با غشای پلاسمایی پیش‌سیناپسی ادغام نمی‌شوند. پایین: ناحیه فعال یک ترمینال که توسط یک پتانسیل عمل تحریک می‌شود؛ تحریک باعث ادغام (فلش‌ها) وزیکول‌های سیناپسی با غشای پیش‌سیناپسی می‌شود. (ج) مقایسه تعداد رویدادهای ادغام وزیکول مشاهده شده با تعداد کوانتوم‌های آزاد شده توسط یک پتانسیل عمل پیش سیناپسی. آزادسازی فرستنده با استفاده از غلظت‌های مختلف دارویی (4-AP) که بر مدت زمان پتانسیل عمل پیش سیناپسی تأثیر می‌گذارد، تغییر داده شد و در نتیجه مقدار کلسیمی که در طول پتانسیل عمل وارد می‌شود را تغییر داد. خط مورب، رابطه 1:1 مورد انتظار است اگر هر وزیکولی که باز می‌شود، یک کوانتوم فرستنده آزاد کند. (C پس از Heuser و همکاران، 1979؛ A و B با احترام از J. Heuser.).

Local Recycling of Synaptic Vesicles

The fusion of synaptic vesicles causes new membrane to be added to the plasma membrane of the presynaptic terminal, but the addition is not permanent. Although a bout of exocytosis can dramatically increase the surface area of presynaptic terminals, this extra membrane is removed within a few minutes. Heuser and Reese performed another important set of experiments showing that the fused vesicle membrane is actually retrieved and taken back into the cytoplasm of the nerve terminal (a process called endocytosis).

بازیافت موضعی وزیکول‌های سیناپسی

ادغام وزیکول‌های سیناپسی باعث می‌شود غشای جدیدی به غشای پلاسمایی پایانه پیش‌سیناپسی اضافه شود، اما این اضافه شدن دائمی نیست. اگرچه یک دوره اگزوسیتوز می‌تواند به طور چشمگیری سطح پایانه‌های پیش‌سیناپسی را افزایش دهد، اما این غشای اضافی ظرف چند دقیقه برداشته می‌شود. هویزر و ریس مجموعه آزمایش‌های مهم دیگری انجام دادند که نشان می‌داد غشای وزیکول ادغام‌شده در واقع بازیابی شده و به سیتوپلاسم پایانه عصبی بازگردانده می‌شود (فرآیندی به نام اندوسیتوز).

The experiments, again carried out at the frog neuromuscular junction, were based on filling the synaptic cleft with horseradish peroxidase (HRP), an enzyme that produces a dense reaction product that is visible in an electron microscope. Under appropriate experimental conditions, endocytosis could then be visualized by the uptake of HRP into the nerve terminal (Figure 5.8). To activate endocytosis, the presynaptic terminal was stimulated with a train of action potentials, and the subsequent fate of the HRP was followed by electron microscopy. Immediately following stimulation, the HRP was found in special endocytotic organelles called coated vesicles, which form from membrane budded off via coated pits (see Figure 5.8B). A few minutes later, however, the coated vesicles had disappeared, and the HRP was found in a different organelle, the endosome (see Figure 5.8C). Finally, within an hour after the terminal had been stimulated, the HRP reaction product appeared inside synaptic vesicles (see Figure 5.8D).

آزمایش‌ها، که دوباره در محل اتصال عصبی-عضلانی قورباغه انجام شد، بر اساس پر کردن شکاف سیناپسی با پراکسیداز ترب کوهی (HRP) بود، آنزیمی که یک محصول واکنش متراکم تولید می‌کند که در میکروسکوپ الکترونی قابل مشاهده است. تحت شرایط آزمایشگاهی مناسب، اندوسیتوز را می‌توان با جذب HRP به ترمینال عصبی مشاهده کرد (شکل 5.8). برای فعال کردن اندوسیتوز، ترمینال پیش‌سیناپسی با قطاری از پتانسیل‌های عمل تحریک شد و سرنوشت بعدی HRP با میکروسکوپ الکترونی دنبال شد. بلافاصله پس از تحریک، HRP در اندامک‌های اندوسیتوزی خاصی به نام وزیکول‌های پوشش‌دار یافت شد که از غشای جوانه‌زده از طریق گودال‌های پوشش‌دار تشکیل می‌شوند (شکل 5.8B را ببینید). با این حال، چند دقیقه بعد، وزیکول‌های پوشش‌دار ناپدید شدند و HRP در اندامک متفاوتی، اندوزوم، یافت شد (شکل 5.8C را ببینید). در نهایت، ظرف یک ساعت پس از تحریک پایانه، محصول واکنش HRP درون وزیکول‌های سیناپسی ظاهر شد (شکل 5.8D را ببینید).

These observations indicate that synaptic vesicle membrane is recycled within the presynaptic terminal via the sequence summarized in Figure 5.8E. In this process, called the synaptic vesicle cycle, the retrieved vesicular membrane passes through several intracellular compartments—such as coated vesicles and endosomes—and is eventually used to make new synaptic vesicles. After synaptic vesicles are re-formed, they are stored in a reserve pool within the cytoplasm until they need to participate again in neurotransmitter release. These vesicles are mobilized from the reserve pool, docked at the presynaptic plasma membrane, and primed to participate in exocytosis once again. More recent experiments, employing a fluorescent label rather than HRP, have determined the time course of synaptic vesicle recycling. These studies indicate that the entire vesicle cycle requires approximately 1 minute, with membrane budding during endocytosis requiring 10 to 20 seconds of this time. As can be seen from the 1-millisecond delay in transmission following excitation of the presynaptic terminal (see Figure 5.5B), membrane fusion during exocytosis is much more rapid than budding during endocytosis. Thus, all of the recycling steps interspersed between membrane fusion and subsequent regeneration of a new vesicle are completed in less than a minute.

این مشاهدات نشان می‌دهد که غشای وزیکول سیناپسی از طریق توالی خلاصه شده در شکل 5.8E در ترمینال پیش‌سیناپسی بازیافت می‌شود. در این فرآیند که چرخه وزیکول سیناپسی نامیده می‌شود، غشای وزیکول بازیابی شده از چندین محفظه درون سلولی – مانند وزیکول‌های پوشش‌دار و اندوزوم‌ها – عبور می‌کند و در نهایت برای ساخت وزیکول‌های سیناپسی جدید استفاده می‌شود. پس از تشکیل مجدد وزیکول‌های سیناپسی، آنها در یک مخزن ذخیره در سیتوپلاسم ذخیره می‌شوند تا زمانی که دوباره نیاز به شرکت در آزادسازی انتقال‌دهنده عصبی داشته باشند. این وزیکول‌ها از مخزن ذخیره بسیج می‌شوند، به غشای پلاسمایی پیش‌سیناپسی متصل می‌شوند و برای شرکت دوباره در اگزوسیتوز آماده می‌شوند. آزمایش‌های جدیدتر، با استفاده از یک برچسب فلورسنت به جای HRP، سیر زمانی بازیافت وزیکول سیناپسی را تعیین کرده‌اند. این مطالعات نشان می‌دهد که کل چرخه وزیکول تقریباً به 1 دقیقه زمان نیاز دارد و جوانه زدن غشا در طول اندوسیتوز به 10 تا 20 ثانیه از این زمان نیاز دارد. همانطور که از تأخیر ۱ میلی‌ثانیه‌ای در انتقال پس از تحریک پایانه پیش‌سیناپسی (شکل ۵.۵B را ببینید) مشاهده می‌شود، ادغام غشا در طول اگزوسیتوز بسیار سریع‌تر از جوانه زدن در طول اندوسیتوز است. بنابراین، تمام مراحل بازیافت بین ادغام غشا و بازسازی بعدی یک وزیکول جدید در کمتر از یک دقیقه تکمیل می‌شود.

FIGURE 5.8 Local recycling of synaptic vesicles in presynaptic terminals. (A) Horseradish peroxidase (HRP) introduced into the synaptic cleft is used to follow the fate of membrane retrieved from the presynaptic plasma membrane. Stimulation of endocytosis by presynaptic action potentials causes HRP to be taken up into the presynaptic terminals via a pathway that includes (B) coated pits and coated vesicles and (C) endosomes. (D) Eventually, the HRP is found in newly formed synaptic vesicles. (E) Interpretation of the results shown in A–D. Calcium-regulated fusion of vesicles with the presynaptic membrane is followed by endocytotic retrieval of vesicular membrane via coated vesicles and endosomes, and subsequent re-formation of new synaptic vesicles. (After Heuser and Reese, 1973.)

شکل ۵.۸ بازیافت موضعی وزیکول‌های سیناپسی در پایانه‌های پیش‌سیناپسی. (الف) پراکسیداز ترب کوهی (HRP) که به شکاف سیناپسی وارد می‌شود، برای دنبال کردن سرنوشت غشای بازیابی شده از غشای پلاسمایی پیش‌سیناپسی استفاده می‌شود. تحریک اندوسیتوز توسط پتانسیل‌های عمل پیش‌سیناپسی باعث می‌شود HRP از طریق مسیری که شامل (ب) گودال‌های پوشش‌دار و وزیکول‌های پوشش‌دار و (ج) اندوزوم‌ها می‌شود، به پایانه‌های پیش‌سیناپسی منتقل شود. (د) در نهایت، HRP در وزیکول‌های سیناپسی تازه تشکیل شده یافت می‌شود. (ه) تفسیر نتایج نشان داده شده در A-D. ادغام وزیکول‌ها با غشای پیش‌سیناپسی که توسط کلسیم تنظیم می‌شود، با بازیابی اندوسیتوزی غشای وزیکولی از طریق وزیکول‌ها و اندوزوم‌های پوشش‌دار و متعاقباً تشکیل مجدد وزیکول‌های سیناپسی جدید دنبال می‌شود. (به نقل از هویزر و ریس، ۱۹۷۳)

The precursors to synaptic vesicles originally are produced in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus in the neuronal cell body. Because of the long distance between the cell body and the presynaptic terminal in most neurons, transport of vesicles from the soma would not permit rapid replenishment of synaptic vesicles during continuous neural activity. Thus, local recycling is well suited to the peculiar anatomy of neurons, giving nerve terminals the means to provide a continual supply of synaptic vesicles.

پیش‌سازهای وزیکول‌های سیناپسی در اصل در شبکه آندوپلاسمی و دستگاه گلژی در جسم سلولی نورون‌ها تولید می‌شوند. به دلیل فاصله زیاد بین جسم سلولی و پایانه پیش‌سیناپسی در اکثر نورون‌ها، انتقال وزیکول‌ها از جسم سلولی اجازه جایگزینی سریع وزیکول‌های سیناپسی را در طول فعالیت عصبی مداوم نمی‌دهد. بنابراین، بازیافت موضعی با آناتومی خاص نورون‌ها کاملاً سازگار است و به پایانه‌های عصبی وسیله‌ای برای تأمین مداوم وزیکول‌های سیناپسی می‌دهد.

The Role of Calcium in Transmitter Secretion

As was apparent in the experiments of Katz and others described in the preceding sections, lowering the concentration of Ca²⁺ outside a presynaptic motor nerve terminal reduces the size of the EPP (compare Figure 5.5B and D). Moreover, measurement of the number of transmitter quanta released under such conditions shows that the reason the EPP gets smaller is that lowering Ca²⁺ concentration decreases the number of vesicles that fuse with the plasma membrane of the terminal. An important insight into how Ca²⁺ regulates the fusion of synaptic vesicles was the discovery that presynaptic terminals have voltage-gated Ca²⁺ channels in their plasma membranes (see Chapter 4).

نقش کلسیم در ترشح انتقال‌دهنده

همانطور که در آزمایش‌های کاتز و دیگران که در بخش‌های قبلی توضیح داده شد، مشخص شد، کاهش غلظت ⁺Ca² در خارج از پایانه عصب حرکتی پیش‌سیناپسی، اندازه EPP را کاهش می‌دهد (شکل 5.5B و D را مقایسه کنید). علاوه بر این، اندازه‌گیری تعداد کوانتوم‌های انتقال‌دهنده آزاد شده در چنین شرایطی نشان می‌دهد که دلیل کوچک‌تر شدن EPP این است که کاهش غلظت ⁺Ca²، تعداد وزیکول‌هایی را که با غشای پلاسمایی پایانه ادغام می‌شوند، کاهش می‌دهد. یک بینش مهم در مورد چگونگی تنظیم ادغام وزیکول‌های سیناپسی توسط ⁺Ca²، کشف این بود که پایانه‌های پیش‌سیناپسی دارای کانال‌های ⁺Ca² وابسته به ولتاژ در غشای پلاسمایی خود هستند (به فصل 4 مراجعه کنید).

The first indication of presynaptic Ca²⁺ channels was provided by Katz and Ricardo Miledi. They observed that presynaptic terminals treated with tetrodotoxin (which blocks voltage-gated Na⁺ channels; see Chapter 3) could still produce a peculiarly prolonged type of action potential. The explanation for this surprising finding was that current was still flowing through Ca²⁺ channels, substituting for the current ordinarily carried by the blocked Na⁺ channels. Subsequent voltage clamp experiments, performed by Rodolfo Llinás and others at a giant presynaptic terminal of the squid (Figure 5.9A), confirmed the presence of voltage-gated Ca²⁺ channels in the presynaptic terminal (Figure 5.9B). Such experiments showed that the amount of neurotransmitter released is very sensitive to the exact amount of Ca²⁺ that enters. Furthermore, blockade of these Ca²⁺ channels with drugs also inhibits transmitter release (see Figure 5.9B, right). These observations establish that the voltage-gated Ca²⁺ channels are directly involved in synaptic transmission: Presynaptic action potentials open these Ca²⁺ channels, yielding an influx of Ca²⁺ into the presynaptic terminal.

اولین نشانه از کانال‌های ⁺Ca² پیش‌سیناپسی توسط کاتز و ریکاردو میلدی ارائه شد. آنها مشاهده کردند که پایانه‌های پیش‌سیناپسی تحت درمان با تترودوتوکسین (که کانال‌های ⁺Na وابسته به ولتاژ را مسدود می‌کند؛ به فصل 3 مراجعه کنید) هنوز هم می‌توانند یک نوع پتانسیل عمل طولانی مدت و عجیب ایجاد کنند. توضیح این یافته شگفت‌انگیز این بود که جریان هنوز از طریق کانال‌های ⁺Ca² جریان دارد و جایگزین جریانی می‌شود که معمولاً توسط کانال‌های ⁺Na مسدود شده حمل می‌شود. آزمایش‌های بعدی گیره ولتاژ، که توسط رودولفو لیناس و دیگران در یک پایانه پیش‌سیناپسی غول‌پیکر ماهی مرکب انجام شد (شکل 5.9A)، وجود کانال‌های ⁺Ca² وابسته به ولتاژ را در پایانه پیش‌سیناپسی تأیید کرد (شکل 5.9B). چنین آزمایش‌هایی نشان داد که مقدار انتقال‌دهنده عصبی آزاد شده به مقدار دقیق ⁺Ca² که وارد می‌شود بسیار حساس است. علاوه بر این، مسدود کردن این کانال‌های ⁺Ca² با داروها نیز آزادسازی فرستنده را مهار می‌کند (به شکل 5.9B، سمت راست مراجعه کنید). این مشاهدات ثابت می‌کند که کانال‌های ⁺Ca² وابسته به ولتاژ مستقیماً در انتقال سیناپسی نقش دارند: پتانسیل‌های عمل پیش‌سیناپسی این کانال‌های ⁺Ca² را باز می‌کنند و باعث ورود ⁺Ca² به ترمینال پیش‌سیناپسی می‌شوند.

FIGURE 5.9 Entry of Ca²⁺ through presynaptic voltagegated calcium channels causes transmitter release. Experimental setup using an extraordinarily large synapse in the squid. The voltage clamp method detects currents flowing across the presynaptic membrane when the membrane potential is depolarized. (B) Pharmacological agents that block currents flowing through Na⁺ and K⁺ channels reveal a remaining inward current flowing through Ca²⁺ This influx of calcium triggers transmitter secretion, as indicated by a change in the postsynaptic membrane potential. Treatment of the same presynaptic terminal with cadmium, a calcium channel blocker, eliminates both the presynaptic calcium current and the postsynaptic response.(After Augustine and Eckert, 1984.)

شکل ۵.۹ ورود ⁺Ca² از طریق کانال‌های کلسیمی وابسته به ولتاژ پیش‌سیناپسی باعث آزادسازی فرستنده می‌شود. چیدمان آزمایش با استفاده از یک سیناپس فوق‌العاده بزرگ در ماهی مرکب. روش گیره ولتاژ، جریان‌های جاری در غشای پیش‌سیناپسی را هنگامی که پتانسیل غشا دپلاریزه می‌شود، تشخیص می‌دهد. (ب) عوامل دارویی که جریان‌های جاری از طریق کانال‌های ⁺Na و ⁺K را مسدود می‌کنند، یک جریان داخلی باقی‌مانده را که از طریق ⁺Ca² جریان می‌یابد، نشان می‌دهند. این هجوم کلسیم باعث ترشح فرستنده می‌شود، همانطور که با تغییر در پتانسیل غشای پس‌سیناپسی نشان داده می‌شود. تیمار همان ترمینال پیش‌سیناپسی با کادمیوم، یک مسدودکننده کانال کلسیم، هم جریان کلسیم پیش‌سیناپسی و هم پاسخ پس‌سیناپسی را از بین می‌برد. (به نقل از آگوستین و اکرت، ۱۹۸۴.)

As is the case for many other forms of neuronal signaling (see Chapter 7), Ca²⁺ serves as a second messenger during transmitter release. Ca²⁺ entering into presynaptic terminals accumulates within the terminal, as can be seen with microscopic imaging of terminals filled with Ca²⁺-sensitive dyes (Figure 5.10A). The presynaptic second messenger function of Ca²⁺ has been directly shown in two complementary ways. First, microinjection of Ca²⁺ into presynaptic terminals triggers transmitter release even in the absence of presynaptic action potentials (Figure 5.10B). Second, presynaptic microinjection of calcium chelators (chemicals that bind Ca²⁺ and keep its concentration buffered at low levels) prevents presynaptic action potentials from causing transmitter secretion Figure 5.10C). These results prove beyond any doubt that a rise in presynaptic Ca²⁺ concentration is both necessary and sufficient for neurotransmitter release. While Ca²⁺ is a universal trigger for transmitter release, not all transmitters are released with the same speed. For example, while secretion of ACh from motor neurons requires only a fraction of a millisecond (see Figure 5.5), release of neuropeptides requires high-frequency bursts of action potentials for many seconds. These differences in the rate of release probably arise from differences in the spatial arrangement of vesicles relative to presynaptic Ca²⁺ channels, yielding differences in the time course of local Ca²⁺ signaling.

همانطور که در مورد بسیاری از اشکال دیگر سیگنالینگ عصبی صدق می‌کند (به فصل 7 مراجعه کنید)، ⁺Ca² در طول آزادسازی فرستنده به عنوان یک پیام‌رسان ثانویه عمل می‌کند. ⁺Ca² که وارد پایانه‌های پیش‌سیناپسی می‌شود، در داخل پایانه تجمع می‌یابد، همانطور که با تصویربرداری میکروسکوپی از پایانه‌های پر از رنگ‌های حساس به ⁺Ca² قابل مشاهده است (شکل 5.10A). عملکرد پیام‌رسان ثانویه پیش‌سیناپسی ⁺Ca² به دو روش مکمل به طور مستقیم نشان داده شده است. اول، تزریق ریز ⁺Ca² به پایانه‌های پیش‌سیناپسی، آزادسازی فرستنده را حتی در غیاب پتانسیل‌های عمل پیش‌سیناپسی تحریک می‌کند (شکل 5.10B). دوم، تزریق ریز پیش‌سیناپسی شلاتورهای کلسیم (مواد شیمیایی که به ⁺Ca² متصل می‌شوند و غلظت آن را در سطوح پایین بافر نگه می‌دارند) از ایجاد ترشح فرستنده توسط پتانسیل‌های عمل پیش‌سیناپسی جلوگیری می‌کند (شکل 5.10C). این نتایج بدون هیچ شکی ثابت می‌کنند که افزایش غلظت ⁺Ca² پیش‌سیناپسی برای آزادسازی انتقال‌دهنده عصبی هم لازم و هم کافی است. اگرچه ⁺Ca² یک محرک جهانی برای آزادسازی انتقال‌دهنده است، اما همه انتقال‌دهنده‌ها با سرعت یکسانی آزاد نمی‌شوند. به عنوان مثال، در حالی که ترشح ACh از نورون‌های حرکتی تنها به کسری از میلی‌ثانیه نیاز دارد (شکل 5.5 را ببینید)، آزادسازی نوروپپتیدها به انفجارهای فرکانس بالای پتانسیل‌های عمل برای ثانیه‌های زیادی نیاز دارد. این تفاوت‌ها در سرعت آزادسازی احتمالاً ناشی از تفاوت در چیدمان فضایی وزیکول‌ها نسبت به کانال‌های ⁺Ca² پیش‌سیناپسی است که منجر به تفاوت در سیر زمانی سیگنالینگ ⁺Ca² موضعی می‌شود.

FIGURE 5.10 Evidence that a rise in presynaptic Ca²⁺ concentration triggers transmitter release from presynaptic terminals. (A) Fluorescence microscopy measurements of presynaptic Ca²⁺ concentration at the squid giant synapse (see Figure 5.9A). A train of presynaptic action potentials causes a rise in Ca²⁺ concentration, as revealed by a dye (called fura-2) that fluoresces more strongly when the Ca²⁺ concentration increases (colors). (B) Microinjection of Ca²⁺ into a squid giant presynaptic terminal triggers transmitter release, measured as a depolarization of the postsynaptic membrane potential. (C) Microinjection of BAPTA, a Ca²⁺ chelator, into a squid giant presynaptic terminal prevents transmitter release. (A from Smith et al., 1993; B after Miledi, 1973; C after Adler et al., 1991.)

شکل ۵.۱۰ شواهدی مبنی بر اینکه افزایش غلظت ⁺Ca² پیش‌سیناپسی باعث آزاد شدن فرستنده از پایانه‌های پیش‌سیناپسی می‌شود. (الف) اندازه‌گیری‌های میکروسکوپی فلورسانس از غلظت ⁺Ca² پیش‌سیناپسی در سیناپس غول‌پیکر ماهی مرکب (شکل 5.9A را ببینید). یک رشته پتانسیل عمل پیش‌سیناپسی باعث افزایش غلظت ⁺Ca² می‌شود، همانطور که توسط یک رنگ (به نام fura-2) نشان داده شده است که با افزایش غلظت ⁺Ca²، فلورسانس بیشتری دارد (رنگ‌ها). (ب) تزریق ریز ⁺Ca² به پایانه پیش‌سیناپسی غول‌پیکر ماهی مرکب باعث آزاد شدن فرستنده می‌شود که به عنوان دپلاریزاسیون پتانسیل غشای پس‌سیناپسی اندازه‌گیری می‌شود. (ج) تزریق ریز BAPTA، یک کلاتور ⁺Ca²، به پایانه پیش‌سیناپسی غول‌پیکر ماهی مرکب از آزاد شدن فرستنده جلوگیری می‌کند. (الف از اسمیت و همکاران، 1993؛ ب از میلدی، 1973؛ ج از آدلر و همکاران، 1991.)

Molecular Mechanisms of Synaptic Vesicle Cycling