ظروف مورد استفاده در آزمایشگاه؛ تجهیزات آزمایشگاه؛ طرز کار با اتوکلاو

وسایل و تجهیزات آزمایشگاه میکروبیولوژی

وسایل و تجهیزات آزمایشگاه میکروبیولوژی

ظروف آزمایشگاه

پیپت

– پیپت های شیشه‌ای و پلاستیکی: این پیپت ها از مواد غیر سمی تهیه شده‌اند و دارای دیواره مستقیم، نوک گرد هستند و برای استفاده در آزمایشگاه میکروب شناسی بکار می‌روند. حداکثر حجمی را که پیپت در مدت ۴ ثانیه خارج می‌کند مقدار یک میلی لیتر با اختلاف ۰/۰۲۵± میلی متر است، این در صورتی است که آخرین قطرهی شیر رقیق نشده موجود در پیپت را با دمیدن در پیپت خارج کنید. پیپت باید طوری درجه بندی شده باشد که در خط نشانه ۲۰ دارای ۱/۰۷۵ میلی لیتر آب باشد، در مورد پیپت هایی که از جنس پلاستیک (Styrene Plastic) می‌باشند درجه بندی طوری است که در خط نشانه ۲۰ حاوی ۱/۰۵۵ میلی‌لیتر آب هستند. فقط پیپت هایی را باید به کار گرفت که نوک آن‌ها سالم و دارای درجه بندی‌های با علامت واضح هستند و با رنگ مایع در رقت‌های مورد استفاده، تضاد داشته باشند. پیپت هایی را که به علل مختلف آسیب دیده‌اند از رده خارج کنید.

جای مخصوص پیپت: از جنس فولاد زنگ نزن یا آلومینیوم است برای این منظور، از لوازمی که با مس ساخته می‌شوند نباید استفاده نمود.

توجه: پس از کاربرد هر نوع پیپت بایستی آن را از طرف نوک در داخل یک محلول سترون کننده قرار داد.

پتری دیش (پلیت): این ظروف دارای حداقل ۸۵ میلی متر قطر داخلی و ۱۲ میلی متر عمق هستند. سطوح داخلی و خارجی این ظروف باید بدون ضایعه یا خراش و حباب باشد. ظروف پتری از شیشه و یا پلاستیک مناسب ساخته می‌شوند و باید دارای کف صاف باشند.

سرنگ فلزی: به منظور انتقال سریع و صحیح مقدار ۰/۰۱ میلی لیتر از مواد غذایی مایع می‌توان از سرنگ‌های فلزی استفاده کرد. این سرنگ‌ها دارای یک میله فنری حساس نیمه خودکار و یک پیستون مناسب از جنس فولاد زنگ نزن برای لوله‌ای از همین جنس و مدرج می‌باشند. سرنگ‌ها دارای یک سری پیچ هستند که برای نمونه برداری مقادیر مختلف مواد غذایی مایع تنظیم می‌گردند. قبل از استفاده باید دقت سرنگ را آزمایش کرد و به طور متناوب دقت و صحت کار آن را بررسی نمود.

تبصره: با این نوع سرنگ‌ها میزان ۰/۰۱ میلی لیتر نمونه مایع به طور دقیق برداشته می‌شود. در مورد شیر و خامه‌های سرد و غلیظ هم می‌توان از این سرنگ استفاده کرد.

سیم کشت: این وسیله از یک قطعه سیم که یک طرف آن آزاد و طرف دیگر آن در داخل دستگیره‌ی از جنس شیشه و یا فلز است، ساخته شده است (شکل ۱- الف). برحسب نوع آزمایش قسمت آزاد ممکن است به صورت حلقه (Loop) و یا بدون حلقه (شکل ۱- د) باشد.

جنس سیم مورد استفاده، معمولاً از لاتین است ولی می‌توان از انواع دیگر نیز استفاده کرد. طول تمام قسمت (دسته و سیم معمولاً ۲۵ سانتی متر و طول سیم حدود ۸ سانتی متر است. در شرایطی که انتهای سیم به صورت حلقه است، مطابق (شکل ۱- ب و ج)، باید آن را به طریق صحیح خم کرد. این وسیله برای انتقال مقدار کمی از محیط جامد یا مایع واجد باکتری به محیط دیگر به کار می‌رود. این وسیله یکی از مهم‌ترین وسایل مورد نیاز در آزمایشگاه میکروبیولوژی است.

لوله‌ها: لوله‌ی آزمایش گرد- انواع متفاوتی از لوله‌های آزمایش تاکنون ساخته شده است. انواعی که در آزمایشگاه باکتریولوژی بیشتر مورد استفاده قرار می‌گیرند، باید در مقابل درجه‌ی حرارت زیاد به هنگام استریل کردن محیط کشت مقاوم باشند. قسمت پایین این لوله‌ها مدور و سر آن‌ها صاف است (شکل ۲- الف). این لوله‌ها برای حفظ محیط کشت، رشد میکروارگانیسم‌ها و مشاهده‌ی پدیده‌های شیمیایی به کار می‌روند.

شکل ۱- ساختمان لوپ

لوله‌ی آزمایش ته صاف، این نوع لوله‌های آزمایش از هر جهت شبیه به نوع قبلی بوده و فقط ته آن‌ها صاف است و به همین علت می‌توان آنها را به آسانی روی میز کار قرار داد (شکل ۲- ب).

لوله‌ی دورهام– این لوله‌ها کوچک و در قسمت پایین مدوراند. قطر داخلی آن‌ها معمولاً ۰/۷ سانتی متر و طول آن‌ها حدود ۲/۵ سانتی متر است. این لوله برای پی بردن به وجود گازهای تولید شده توسط برخی از میکروارگانیسم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند (شکل ۲- ج).

شکل ۲- انواع مختلف لوله‌های مورداستفاده در آزمایشگاه میکروبیولوژی. الف – لوله‌ی گرد؛ ب- لوله‌ی پهن؛ ج – لوله‌ی دورهام؛ د- لوله‌ی کاریجی

لوله‌ی کاریجی– این لوله‌ها در دو انتها باز بوده و قطر آنها حدود ۰/۷ سانتی متر و طول آن‌ها ۵ سانتی متر است و برای مشاهده‌ی حرکت باکتری‌ها از این لوله‌ها استفاده می‌شود (شکل ۲- د).

لوله‌های ته گرد معمولاً در جا لوله‌ای فلزی و یا در زنبیل‌های سیمی (شکل ۳) نگهداری می‌شود.

شکل ۳- زنبیل سیمی مخصوص نگاهداری لوله‌های واجد محیط کشت

بطری‌های رقیق کننده: بطری‌هایی از جنس بور و سیلیکات با درپوش‌های پیچ¬دار یا سر بطری‌های لاستیکی به گنجایش ۱۵۰ میلی لیتر مورد استفاده قرار می‌گیرند. برای جلوگیری از تراوش مایع از درپوش‌های پیچ دار می‌توان از واشرهای مناسب و غیر قابل نفوذ استفاده کرد. بطری‌های تهیه رقت را در حجم ۱ ± ۹۹ میلی لیتر می‌توان با مواد مناسب یا وسیله‌ای که پاک نشود علامت گذاری کرد. برای از بین بردن باقیمانده‌ی مواد و مایعات از درب‌های لاستیکی مخصوص بطری، لوله یا سایر ظروف، باید ابتدا آن‌ها را در آب معمولی با حرارت  ۸۲ درجه سانتی‌گراد و یک ماده پاک کننده تمیز کرد.

وسایل شیشه‌ای دیگر نظیر ارلن مایر درب پیچ دار، بشر، لوله آزمایش درب پیچ دار، لام و لامل شیشه‌ای، قاشقک نمونه برداری، آنس فلزی برای کشت میکروبی، همگی جزو ظروف مورد استفاده در آزمایشگاه میکروب شناسی می‌باشند.

تجهیزات آزمایشگاه

گرمخانه (اینکوباتور) (Incubator): دستگاهی است که برای رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌ها در دمای ثابت مورد استفاده قرار می‌گیرد. ساختمان گرمخانه باید صحیح باشد و مرتباً کنترل شود، دمای داخل گرمخانه نباید از حد تنظیم شده بیش از ۱± درجه سانتی‌گراد تغییر نماید. اختلافات دمای داخل گرمخانه را در زمانی که ظرفیت آن پر شده است تعیین و مشخص کنید. گرمخانه باید به صورتی پر شود که فاصله بین ردیف پتری دیش‌ها و بین آن‌ها و دیواره‌ی گرمخانه از ۲/۵ سانتی متر کمتر نباشد، ظروف قرار داده شده در گرمخانه باید در مدت ۲ ساعت به دمای مورد نظر برسند. اتاق‌های گرم باید به خوبی عایق و مجهز به سیستم‌های مناسب پخش حرارت و گردش هوا (پنکه) باشند. میزان رطوبت داخل آن‌ها باید به نحوی باشد که باعث جمع شدن قطرات آب در روی ظروف و گسترش سریع کشت نگردد. از طرف دیگر رطوبت باید به میزانی باشد که ظروف حاوی آگار بیش از ۱۵ درصد رطوبت خود را در مدت ۴۸ ساعت از دست ندهد. گرمخانه باید در مکانی قرار گیرد که دمای آن در مواقع مختلف سال بین ۲۷-۱۶ سانتی‌گراد باشد برای استفاده بهتر از گرمخانه، کارکنان آزمایشگاه موظف به انجام موارد زیر هستند.

شکل ۴- نمونه‌ای از اینکوباتور یا اتاقک کشت موجود در آزمایشگاه

الف) ثبت دمای قسمت‌های بالایی و پایینی گرمخانه و اتاق‌های گرم به تعداد دو بار در روز یک مرتبه صبح، بعد از این که تمام مدت شب در گرمخانه بسته بوده است و یک مرتبه بعد از پایان کار روزانه.

ب) تنظیم دستگاه تنظیم کننده‌ی گرما (Thermoregulator): گرماسنج‌ها را در طبقه‌های پایین و بالا و در صورت لزوم در وسط قرار دهید. قسمت حباب مدور گرماسنج‌ها را در داخل یک آمپول به صورت کاملاً بسته قرار دهید و در آب شناور کنید، زیرا درجه گرمای هوا شاخص مطمئنی برای تعیین درجه گرمای آگار به شمار نمی‌آید در صورت تمایل می‌توان برای کنترل و ثبت حرارت گرمخانه و اتاق‌های گرم از ادوات خودکار تنظیم درجه گرما که رقت آن‌ها قبلاً تعیین شده است استفاده کرد. در فواصل زمانی معین می‌توان دقت این ادوات را با درجات گرماسنج‌های استاندارد کنترل نمود. زمانی که از گرماسنج‌های استاندارد استفاده می‌شود ممکن است در هر گرمخانه، گرماسنج‌هایی که حداقل و حداکثر درجه گرما را نشان می‌دهند قرار داد تا انحرافات نامعلوم و درجه آن‌ها تعیین شود. برای ثبت روزانه درجه گرما از قرائت این گرماسنج‌های اختصاصی خودداری کنید. زمانی که برای کنترل و ثبت درجات گرما از ادوات خودکار که دقت آن‌ها قبلاً تعیین شده است و به طور مرتب کار می‌کنند استفاده می‌گردد، احتیاجی به کاربرد گرماسنج‌هایی که حداقل و حداکثر درجه حرارت را نشان می‌دهند نیست.

شکل ۵- نمونه‌ای از ترازوی دیجیتال مخصوص و زن کردن مواد در آزمایشگاه

ترازو: ترازوی با حساسیت ۰/۱ تا ۰/۰۱ گرم و با مقدار ۲۰۰ گرم و با مقدار ۲۰۰ گرم وزنه مورد نیاز است برای این منظور، ترازوی یک کفه‌ای با ظرفیت ۲ کیلو گرم مناسب‌تر است.

دستگاه کلنی کانتر یا دستگاه پرگنه شمار: در مرحله بعد از کشت و طی دوره‌ی رشد و تکثیر، پرگنه (کلنی)‌های حاصل شده در محیط کشت نشان دهنده‌ی تقریبی میزان آلودگی کلی در مقدار کشت داده شده از نمونه می‌باشد و به این صورت که هر یک پرگنه (کلنی) کوچک و یا بزرگ، نمایانگر حداقل یک میکروارگانیسم فعال اولیه در نمونه به شمار می‌آید و تعداد کل میکروارگانیسم‌ها بر اساس تعداد پرگنه (کلنی)‌ها بر مبنای درجه‌ی دقت نمونه تعیین و محاسبه می‌گردد. برای شمارش تعداد پرگنه (کلنی)‌ها در محیط کشت معمولاً از دستگاهی به نام کلنی کانتر (Colony Counter) استفاده می‌شود. این دستگاه از چند قسمت مشخص تشکیل شده است : ذره بین، صفحه مدور تقسیم بندی شده به اشکال مربع شکل، نمراتور و لامپ برق برای انجام کار، پلیت دارای پرگنه روی صفحه‌ی مدور قرار گرفته، نور چراغ، صفحه را روشن می‌کند فرد شمارش کننده با فشار انگشت روی دگمه نمراتور موجب ثبت تعداد پرگنه (کلنی)‌ها روی قسمت نمراتور می‌گردد. وجود اشکال مربع شکل موجب دقت بیشتر و جلوگیری از خطا در شمردن پرگنه (کلنی)‌ها می‌گردد.

شکل ۶– دو نمونه از پرگنه شمار یا کلنی کانتر آزمایشگاه میکروبیولوژی

بن ماری: در اندازه‌های مختلف و مناسب برای مقاصد آزمایشگاه طرح ریزی و از آن‌ها برای نگهداری محیط‌های ذوب شده در ۴۵-۴۴ درجه سانتی‌گراد استفاده می‌گردد. در مواقع عدم استفاده از حمام آب، در آن باید بسته باشد. سطح آب داخل آن باید به اندازه‌ای باشد که کاملاً سطح آگار موجود در ارلن یا ظروف دیگر را بپوشاند.

یخچال: برای خنک نگه داشتن نمونه‌ها از یخچال با دمای ۴+ درجه سانتی‌گراد استفاده می‌شود. این دستگاه، در صورت تمایل برای نگهداری محیط‌های کشت نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد.

شکل ۷- نمونه‌ای از بن ماری یا حمام آب گرم

شکل ۸- نمونه‌ای از شیکر مخصوص پتری دیش و ارلن آزمایشگاهی

شکل ۹- نمونه‌ای از همزن مجهز به هیتر در آزمایشگاه

تکان دهنده‌ی مکانیکی (Mechanical Shaker): تکان دهنده‌های مکانیکی برای یکنواخت کردن محتوای ظروف مناسب می‌باشند و کار آنها شکستن مجموعه‌های میکروبی در لوله و ارلن است. برای این منظور دستگاه باید دارای حرکت چرخشی باشد.

سانتریفوژ: این دستگاه‌ها دارای انواع مختلف می‌باشند که براساس نیروی گریز از مرکز، موادی را که دارای جرم‌های مخصوص متفاوت هستند از یکدیگر تفکیک می‌کنند.

شکل ۱۰- نمونه‌ای از دستگاه سانتریفوژ آزمایشگاهی

دماسنج‌ها: با درجه بندی مناسب (بالا و پایین صفر)، پر شده از جیوه با فاصله درجه بندی حداقل یک درجه سانتی گراد هستند. دقت آنها حداقل هر دو سال یک بار با یک گرماسنج تأیید شده از سوی مؤسسه ملی استاندارد (یا نوع دیگر با دقت مشابه) کنترل شود در مواقعی که ثبت درجه‌ای در یخچال، اتوکلاو، کوره با هوای داغ یا گرمخانه مورد نظر است می‌توان از ادوات ثبت درجه گرمای خودکار استفاده کرد. معمولاً دو نوع گرماسنج جیوه‌ای در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرد: نوعی که به طور کامل در محیط (مثل گرم خانه یا یخچال) قرار می‌گیرد تا گرمای محیط را تعیین کند، نوع دیگر که قسمتی از آن در محیط مورد نظر قرار می‌گیرد (حمام آب) در نوع دوم در نقطه‌ای که گرماسنج در آب قرار دارد خطی مشخص دور تا دور بدنه گرماسنج کشیده شده است. ساده‌ترین راه برای امتحان گرماسنج‌های آزمایشگاه، مقایسه‌ی آن‌ها با گرماسنج‌های استاندارد در شرایط مشابه مانند حمام آب است.

شکل ۱۱- نمونه‌ای از دماسنج‌های آزمایشگاهی

چراغ الکلی- آون و اتوکلاو برای استریل کردن

استریل کردن (Sterilization): استریل کردن یعنی عقیم کردن و بی حاصل نمودن و در اینجا منظور کشتن و از بین بردن کلیه موجودات ذره بینی است.

روش‌های سترون کردن

روش‌های معمول سترون کردن شامل، سترون کردن با دما، صاف کردن (Filtration)، گاز دادن (Furnigation) و تابش اشعه (Irradiation) می‌باشد.

الف- سترون کردن به وسیله‌ی دما

۱- سوزاندن: میکروارگانیسم‌های موجود روی اجسام را (مانند حلقه کشت) بر روی شعله قرار می‌دهند تا زمانی که جسم کاملاً سرخ شود. اگر میکروارگانیسم موجود بر روی حلقه کشت مخصوص انتقال میکروب فوق العاده بیماری‌زا باشد، عمل انتقال و سترون کردن حلقه محیط کشت بهتر است در محفظه به خصوصی صورت گیرد. از سوزاندن برای مواد آلوده‌ای را که قابل مصرف دوباره نیستند، استفاده می‌شود.

۲- دمای خشک: برای وسایلی مانند پیپت ها و تشتک‌های پتری سترون کردن با حرارت خشک انجام می‌شود. همه‌ی وسایل را می‌توان در هوای گرم دستگاه سترون کننده گذاشت و درجه حرارت را به مدت یک ساعت در ۱۷۰ درجه سانتی گراد نگه داشت. برای موادی که به وسیله‌ی حرارت خشک یا حرارت مرطوب بالا خراب می‌شوند سترون کردن متناوب (تیندالیزاسیون) (Tyndallization) به کار می‌رود.

مواد را به مدت ۳۰ دقیقه در سه روز متوالی با جریان بخار آب (۱۰۰ درجه سانتی گراد) حرارت داده، بین مراحل حرارت دادن، بگذارید درجه حرارت آن برابر درجه حرارت آزمایشگاه باشد. این روش سترون کردن به دلیل اشکالات آن در بیشتر موارد رضایت بخش نیست.

شکل ۱۲- طریقه‌ی صحیح سترون کردن حلقه محیط کشت

۳- دمای مرطوب: برای بیشتر انواع محیط‌های کشت، لباس‌ها، مواد لاستیکی، و سایر موادی که با حرارت خشک خراب می‌شوند، روش سترون کردن به وسیله‌ی حرارت مرطوب و زیر فشار بکار می‌رود. چنین موادی را در حرارت ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ الی ۳۰ دقیقه با بکار بردن بخار آب با ۱۵ پوند فشار اتوکلاو می‌کنند. گاهی زمان لازم برای سترون کردن کامل، بر حسب نوع و مقدار مواد به کار رفته تغییر می‌کند.

روش کار با اتوکلاو

هدف: آشنایی با روش کار دستگاه اتوکلاو و طرز تهیه ظروف، وسایل آزمایشگاهی و محیط کشت استریل

طرز کار دستگاه سترون کننده فشار – بخار یا اتوکلاو

۱- فلاسک‌های حاوی محیط کشت میکروبی را که قبلاً تهیه کرده‌اید در دستگاه سترون کننده قرار دهید.

۲- در دستگاه را بسته، آن را قفل کنید.

۳- شیر دستگاه (دریچه‌ی خروج هوا) را باز کنید تا بخاری که تشکیل می‌شود جانشین هوای داخل دستگاه گردد (تا زمانی که بخار بدون هوا خارج می‌شود).

۴- شیر مربوط به قسمت بخار را ببندید. این کار باعث می‌شود که بخار در داخل اتوکلاو جمع شده، فشار آن افزایش یافته و دما به حد مورد نظر برسد.

توجه: در بعضی از دستگاه‌ها، شیر خروج هوا به طور خودکار به وسیله‌ی تنظیم ترمو استاتیکی (Thermiostatic) بسته می‌شود.

اتوکلاوهایی که برای سترون کردن در آزمایشگاه‌های معمولی به کار می‌روند اغلب برای ۱۵ پوند بر اینچ مربع (PSI) فشار تنظیم شده‌اند که ۱۲۱ درجه سانتی گراد (۲۵۰ درجه فارنهایت) گرما تولید می‌کنند. زمان مناسب برای حرارت دهی در این حد (سترون کردن) بستگی به عوامل مختلف دارد. هنگامی که درجه حرارت به ۱۲۱ درجه سانتی گراد رسید، زمان شروع سترون کردن به حساب می‌آید. توجه داشته باشید که حرارت سنج، درجه حرارت بخار را در لوله‌ی خروج بخار اندازه گیری می‌کند. اگر هوا به طور کامل از اتوکلاو خارج نشده باشد گرچه فشار سنج ۱۵ پوند بر اینچ مربع فشار را نشان دهد، درجه حرارت به ۱۲۱ درجه سانتی گراد نخواهد رسید. بنابراین شروع سترون کردن را باید لحظه‌ای دانست که حرارت سنج به ۱۲۱ درجه سانتی گراد برسد، نه از زمانی که فشارسنج ۱۵ پوند بر اینچ مربع فشار را نشان می‌دهد.

۵- با خاتمه‌ی سترون کردن، برای باز کردن اتوکلاو، کاری را که باید انجام دهید عبارتست از ۱- بستن دریچه ورودی ؛ ۲- بسته نگه داشتن شیر خروج بخار دستگاه تا هنگامی که فشار به صفر نزدیک شود. اگر موادی که سترون می‌شوند حاوی مایعات نباشند می‌توانید برای کاهش دادن سریعتر فشار، شیر خروج بخار را باز کنید. اگر در اتاقک اتوکلاو مایعات وجود داشته باشند، چنین کاهش فشاری، باعث جوش آمدن آنها در ظروف خود شده، پنبه سر درب آن‌ها را خیس کرده، آن‌ها را به خارج پرتاب می‌کند. از این رو در مواقعی که مایعات سترون می‌شوند، همیشه لازم است فشار را به تدریج کاهش داد. بیشتر اتوکلاوهای جدید، که خیلی از آن‌ها کاملاً اتوماتیک هستند دارای قفل‌های خودکار بر روی در خود می‌باشند، تا وقتی که فشار کاهش نیافته به در اجازه باز شدن نمی‌دهند.

۶- بعد از آن که فشار سنج نشان داد که دیگر هیچگونه فشار مربوط به بخار وجود ندارد می‌توانید در اتو کلاو را باز کرده، مواد و وسایل داخل آن را خارج کنید. اگر مواد سترون کردن در اثر حرارت طولانی یا در اثر بخار آب امکان فاسد شدن دارند، آن‌ها را بدون وقفه خنک کنید.

بعضی از عوامل مؤثر در سترون کردن به وسیله‌ی فشار و بخار در دستگاه اتوکلاو

الف- درجه حرارت: آندوسپور باکتری‌ها در برابر مرگ در اثر حرارت بیشترین مقاومت را دارند و درجه حرارت کشنده برای آن‌ها فقط هنگامی حاصل می‌شود که بخار آب دارای فشار زیاد باشد. درجه حرارت ۱۲۱ درجه‌ی سانتی‌گراد هنگامی که برای مدت مناسبی ادامه یابد شرایط خوبی را برای سترون کردن ایجاد می‌کند.

ب- رطوبت: انعقاد ترکیبات پروتوپلاسم باکتری‌ها (پروتئین‌ها، آنزیم‌ها و غیره) در دمای اتوکلاو، به رطوبت نیاز دارد و هنگامی که رطوبت در محیط نباشد، دمایی که برای انعقاد ضروری است به سرعت افزایش می‌یابد. اگر بخار خیلی گرم شود، خشک‌تر می‌شود، بنابراین درجه حرارت و مدت لازم برای سترون کردن باید افزوده شده، به میزان سترون کردن در هوای خشک (۱۷۰ درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت) برسد.

بنابراین حرارت دادن زیاد بخار می‌تواند مقداری از اثر آن را به عنوان عامل کشنده از بین ببرد. علاوه بر این، افزایش درجه حرارت می‌تواند روی موادی که سترون می‌شوند اثر تخریب کننده داشته باشد.

شکل ۱۳- نمونه‌ای از دستگاه اتوکلاو مخصوص استریل کردن با بخار تحت فشار

ج- فشار: فشار به میزانی که در اتوکلاو به کار می‌رود، هیچ گونه اثری در سترون کردن ندارد. فشار فقط برای رساندن درجه حرارت بخار به بالاتر از ۱۰۰ درجه سانتی گراد لازم است.

د- زمان: زمان برای نفوذ بخار آب و گرم کردن مواد تا درجه حرارت سترون کردن ضروری است. حتی، هنگامی که چنین درجه حرارتی حاصل شود، اسپورها و سلول‌های جوان همه یک باره کشته نمی‌شوند. میزان مرگ و میر در یک درجه حرارت مشخص ثابت است و در مقابل یک عامل کشنده ، در هر واحد زمانی، نسبت ثابتی از یک تعداد معین میکروبی کشته می‌شوند. (به طور طبیعی در ۱۲۱ درجه سانتی گراد و گرمای مرطوب) ۲/۵ دقیقه وقت لازم است تا آندوسپور باکتری‌های گرما دوست کشته شوند.

هـ- مزاحمت هوا: هوای داخل اتوکلاو در درجه حرارت سترون کردن بیش از دو برابر بخار سنگینی دارد. اگر این هوا خارج نشود، در داخل اتوکلاو چند طبقه تشکیل می‌شود. از آن جا که بخار و هوا به کندی مخلوط می‌شوند تفاوت درجه حرارت لایه بالایی و لایه پایینی ممکن است خیلی زیاد باشد از این رو خارج کردن تمام هوا لازم است. گرماسنجی که در شیر تخلیه قرار دارد وقتی که ۱۰۰ درجه سانتی گراد را نشان می‌دهد، مشخص می‌کند که تمام هوای داخل اتو کلاو خارج شده است.

و- ماهیت بار اتوکلاو: معمولاً مواد حجیم و تقریباً غیر قابل نفوذ احتیاج به زمان بیشتری برای سترون شدن دارند. بنابراین بهتر است آن‌ها را در واحدهای کوچکتر سترون کرد یا برای مثال به جای یک فلاسک ۵ لیتری بهتر است آنها را در ۵ فلاسک یک لیتری قرار داد. موادی که در برابر بخار قابلیت نفوذ کم دارند و مواد خیلی حجیمی که نمی‌توان از راه تماس آن‌ها را حرارت داد، احتیاج به زمان طولانی‌تری دارند. سر فلاسک ها را باید به وسیله‌ی پنبه یا کاغذ پوشاند. اگر به کار بردن درب لاستیکی، درب پیچی، یا درب پلاستیکی ضرورت دارد، برای این که هوا براحتی خارج شود، همین طور برای جلو گیری از شکستن و پرتاب شدن درب و ظروف در اثر خروج بخار، و برای داخل شدن و نفوذ بهتر بخار به داخل ظروف نباید سر آن‌ها را محکم بست.

فکر کنید و پاسخ دهید:

۱- فرضیه‌ای که براساس آن سترون کردن متناوب پایه گذاری شده است چیست؟

۲- به عنوان یک عامل سترون کننده، دمای خشک مؤثرتر است یا دمای مرطوب؟ چرا؟

ب- صافی‌ها: خیلی از مواد (مثلاً بعضی قندها و سرم های خون) در درجه حرارتی که معمولاً برای سترون کردن به کار می‌رود، خراب می‌شوند. برای سترون کردن این مواد حساس به گرما که ممکن است مایع و یا به صورت محلول باشند می‌توان از صاف کردن (filtration) استفاده کرد. در این روش صافی‌ها به دو طریق باکتری‌ها را می‌گیرند. یکی به وسیله‌ی عمل مکانیکی غربال مانند سوراخ‌های کوچک صافی و دیگری با جذب میکروب‌ها توسط صافی به دلیل تفاوت بار الکتریکی آن‌ها.

صافی‌ای که به طور گسترده در میکروبیولوژی به کار می‌رود صافی غشایی است. صافی غشایی، یک غشای سلولز و یا پلاستیکی است که سوراخ‌های کوچکی دارد (معمولاً ۰/۴۵ میکرون) و می‌تواند باکتری‌ها را از یک مایع گرفته، جدا کند. سایر صافی‌هایی که در سترون کردن به کار می‌روند عبارتند از صافی شیشه‌ای؛ صافی ساتیز (Seitz) که از پنبه نسوز است؛ صافی‌های شمعی شکل شامبرلان و سلاس (Selas) و صافی مندلر (Mandler). صافی شیشه‌ای را معمولاً از شیشه پیرکس گداخته به ترتیبی تهیه می‌کنند که سوراخ دار باشد و اندازه و بار الکتریکی جاذب سوراخ‌ها به اندازه‌ای است که برای گرفتن باکتری‌ها کافی است. صافی‌های ساتیز صفحات گرد فشرده پنبه نسوز هستند که دارای سوراخ‌های کوچک مناسب برای گرفتن باکتری‌ها می‌باشند. صافی‌های شامبرلان و سلاس از سفال بدون لعاب و صافی مندلر از خاک دیاتومه ساخته شده‌اند. سه صافی اخیر، به شکل استوانه‌های دراز و توخالی شبیه شمع هستند که یک طرف آن‌ها باز است.

شکل ۱۴- دستگاه صافی غشایی

تمام این صافی‌ها را به یک فلاسک مکنده وصل کرده، با به کار بردن نیروی مکش مواد مایع را از درون آن‌ها می‌گذرانند و بدین طریق کلیه میکروب‌های آلوده کننده را گرفته، از محیط خارج می‌کنند. در شکل زیر نمایش صاف کردن را که یکی از روش‌های سترون کردن است ملاحظه کنید.

ج- لامپ اشعه U.V: برای سترون سازی محیط آزمایشگاه کاربرد دارد. این لامپ باید زمانی روشن باشد که کارکنان در محل کار حضور ندارند.

شکل ۱۵- طیف نور در منطقه مؤثر در استریل کردن

خودآزمایی

۱- مشخصات ظروف پتری دیش را بنویسید.

۲- استریل کردن را تعریف نموده، انواع روش‌های آن را نام ببرید.

۳- تیندالیزاسیون چیست؟

۴- طرز سترون کردن با صافی را شرح دهید.

۵- روش کار با اتوکلاو را شرح دهید.

۶- نقش فشار بخار در اتوکلاو برای سترون کردن چیست؟

۷- وسیله‌ی شمارش تعداد پرگنه ها چه نامیده می‌شود و از چه قسمت‌هایی تشکیل شده است؟

۸- کار تکان دهنده‌ی مکانیکی در آزمایشگاه چیست؟