هدف‌های رفتاری: در پایان این مطلب، فراگیر باید بتواند:
۱- روش پورپلیت یا استاندارد را برای شمارش باکتری‌های فعال انجام دهد.
۲- سایر روش‌های شمارش باکتری‌ها را انجام داده، آنها را با یکدیگر مقایسه نماید.
۳- وسایل و تجهیزات آزمایشگاهی لازم برای شمارش میکروارگانیسم‌ها را شناسایی نماید.
۴- نمونه‌ای از مواد غذایی اطراف خود مانند آب آشامیدنی را مورد آزمون قرار دهید.
۵- روش‌های کشت بی هوازی باکتری‌ها را شرح دهد.
روش‌های کشت میکروارگانیسم‌ها
کشت میکروارگانیسم‌های هوازی
برای شمارش میکروارگانیسم‌ها چندین روش وجود دارد که بترتیب توضیح داده می‌شوند.
روش کشت پورپلیت یا استاندارد پلیت کانت(Standard plate count (SPC)):
این روش به طور وسیعی در موارد مختلف کنترل بهداشتی و صنعتی و استاندارد کردن بکار می‌رود و به اعتقاد متخصصان، دقیق‌ترین روش برای تعیین تعداد باکتری‌های فعال قادر به رشد در محیط کشت بکار رفته می‌باشد (البته روش‌های اتوماتیک و جدیدی با استفاده از تکنیک‌های پیشرفته ارائه شده‌اند که ادعا می‌شود از دقت بسیار زیادی برخوردارند ولی هنوز این روش‌ها عمومیت نیافته‌اند. در روش پورپلیت با توجه به رقت‌های مختلف تهیه شده از نمونهی غذایی برای هر رقت ۲ تا ۴ ظرف پتری اختصاص داده می‌شود و یک ظرف نیز به عنوان کنترل برای اطمینان از سترون بودن پلیت ها و محیط کشت در نظر گرفته می‌شود. روی ظروف پتری را با شماره‌ی نمونه، رقت و تاریخ آزمایش مشخص کرده، در هر دو یا چهار ظرف پتری از رقت مربوط، یک میلی لیتر قرار می‌دهند (می‌توان با یک پیپت از رقیق‌ترین لوله شروع کرده، هر بار پس از ریختن نمونه داخل ظرف پتری، پیپت را در رقت دوم خوب شستشو داد و از آن برداشت کرد) به این ترتیب با استفاده از یک پیپت، کلیه‌ی رقتها به پلیت منتقل می‌شوند. محیط کشت مناسب ذوب و در حمام ماری C° ۴۵ درجه سانتی گراد نگهداری می‌شود پس از ریختن رقت‌های مختلف ماده غذایی به داخل پلیت، به هر ظرف حدود ۱۵ میلی لیتر از محیط کشت مذاب که دمای آن بیشتر از C° ۴۵ نباشد اضافه می‌شود (در مورد باکتری‌های ترموفیل دمای محیط کشت می‌تواند بیشتر باشد) پس از آن بلافاصله در ظرف را بسته، آن را ۵ بار از عقب به جلو، ۵ بار در جهت حرکت عقربه‌های ساعت، ۵ بار از چپ به راست و بالاخره ۵ بار در جهت خلاف حرکت عقربه‌های ساعت به آرامی حرکت می‌دهند تا نمونه و محیط کشت بخوبی مخلوط شوند. کمی صبر کنید تا محیط ببندد. بعد، از محیط مایع که همچنان در حمام ماری نگهداری شده مقدار کمی روی هر پلیت می‌ریزند به طوری که لایه نازکی از محیط سطح پلیت را بپوشاند. در نتیجه‌ی این عمل از آلوده شدن سطحی جلو گیری می‌شود و همچنین تا اندازه‌ای شرایط بی هوازی برای نشان دادن حالات تخمیری برخی از باکتری‌ها ایجاد می‌گردد. پس از بسته شدن لایه دوم، پلیت را به طور واژگون در گرمخانه با توجه به درجه دما مناسب رشد باکتری مربوط قرار می‌دهند باکتری‌های سرماگرا در C° ۵- ۰ و باکتری‌های مزوفیل C° ۳۷ – ۲۵ و باکتری‌های گرمادوست در C° ۵۵) دمای انتخابی با توجه به هدفی که از شمارش باکتری مورد نظر است انتخاب می‌شود. در مورد غذاهایی که در حالت انجماد نگهداری می‌شوند دمای (۵-۰) C° ۳۵ هر دو را انتخاب می‌کنند تا ضمن شمارش باکتری‌های سرمادوست، میکروب‌های بیماری¬زا نیز مشخص گردند. ولی چنانچه هدف شمارش آلوده کننده‌های گرمادوست باشد که در کارخانه‌ها از راه پمپ‌ها و دستگاه‌ها وارد مواد غذایی می‌شوند باید دمای ۵۵ را انتخاب کرد. به هر حال انتخاب دما به دلیل اهمیتی که دارد باید در نتیجه آزمایش قید گردد. کشت‌ها را مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه نگهداری می‌کنند و پس از این مدت به کمک دستگاه پرکنه شمار، پرگنه های ظاهر شده در پلیت را که بین ۳۰۰- ۰ پرگنه دارند می‌شمارند. ۲۴ ساعت دیگر ظروف را در گرمخانه قرار داده، پس از این مدت یک بار دیگر نیز تعداد پر گنه‌ها را می‌شمارند. میانگین تعداد پرگنه های شمارش شده در دو یا چهار پلیت با در نظر گرفتن رقت آن تعداد میکروارگانیسم‌های موجود در ماده‌ی غذایی را تعیین می‌کند. در ظرفی که به عنوان کنترل سترون بودن در نظر گرفته شده نباید هیچ پرگنه ظاهر گردد. مدت گرمخانه گذاری در مورد باکتری‌های گرمادوست (Termophylic) و میان دمادوست (Mesophylic) ۲۴ تا ۴۸ ساعت و در مورد سرمادوست‌ها (Psychrophylic) بیشتر می‌باشد ولی برای قارچ‌ها و مخمرها ممکن است یک هفته یا بیشتر ادامه یابد.
روش کشت سطحی: در این روش باید ظروف پتری حاوی محیط کشت تهیه شده باشند و سطح محیط با قرار دادن آنها در گرمخانه C° ۵۵-۵۰ به مدت نیم تا دو ساعت خشک شود. در این مدت باید در پلیت باز و سطح محیط رو به پایین باشد و یا می‌توان محیط‌های کشت را با در بسته به مدت ۴ ساعت در گرمخانه C° ۳۷ قرار داد تا خشک شوند. سپس با توجه به رقت‌های تهیه شده، برای هر رقت ۲ تا ۴ پلیت انتخاب نمود و یک ظرف به عنوان کنترل منفی در نظر گرفت. روی هر ظرف پتری را با شماره‌ی نمونه رقت و تاریخ کشت مشخص می‌کنند و پس از تهیه رقتها، از رقیق‌ترین آنها به کمک پیپت ۱/۰ میلی لیتری برداشت کرده، در سطح محیط می‌ریزند و بعد همان پیپت را در رقت بعدی که ۱۰ برابر بیشتر است سه بار شسته و ۱/۰ از آن را برداشته، در پلیت مربوط می‌ریزند. به همین ترتیب ادامه داده می‌شود تا آخرین رقت، سپس برای هر رقت از یک پخش کننده‌ی شیشه‌ای سترون استفاده کرده، نمونه را بخوبی در سطح پلیت می‌گسترانند. (برای تهیه پخش کننده، یک میله شیشه‌ای را به کمک شعله تحت زاویه ۹۰ درجه خم کرده، سترون می‌کنند). نحوه حرکت میله شیشه‌ای یا آنس پلاتین روی سطح محیط کشت باید به گونه‌ای باشد که از زخمی کردن سطح محیط کشت جلوگیری کند. انجام این کار با استفاده از میله شیشه‌ای سترون آسان‌تر می‌باشد. سپس پلیت را مانند روش قبل با توجه به انتخاب و زمان گرمخانه گذاری، مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه C° ۴۵±۳۵ قرار داده، پس از ۲۴ ساعت ظروفی را که بین ۳۰۰ -۰ پرگنه دارند می‌شمارند. دوباره ظروف را برای ۲۴ ساعت دیگر گرمخانه گذاری کرده، پس از آن پرگنه ها را شمارش می‌کنند و میانگین شمارش را بدست می‌آورند تعداد باکتری‌ها در یک گرم از ماده‌ی غذایی با توجه به میانگین پر گنه‌ها و رقت بکار رفته محاسبه می‌شود.
روش کشت قطرهای: در این روش از پیست‌های پاستور کالیبره که حجم قطرات آنها مشخص می‌باشد استفاده می‌شود (پیپت هایی که ۲۰، ۲۵ یا ۴۰ قطره آنها یک میلی لیتر است) ظروف پتری حاوی محیط کشت به همان ترتیب روش شمارش سطحی تهیه و سطح آنها خشک می‌شود. سپس با ماژیک یا مداد روغنی ظروف پتری را در قسمتی که حاوی کشت می‌باشد به سه قسمت مساوی تقسیم می‌کنند.
شکل ۱- حرکت انس روی سطح پلیت با دو روش
پس از قید شماره، هر یک از سه بخش را به یک رقت اختصاص می‌دهند. (رقت ۱-۱۰، ۲-۱۰ و ۳-۱۰ که نماینده‌ی رقت‌های ۱/۰ و ۰۱/۰ و ۰۰۱/۰ می‌باشد) بدین ترتیب برای هر رقت دو تا چهار ظرف در نظر گرفته می‌شود. بعد به کمک یک پیپت پاستور کالیبره که سر آن به یک حباب لاستیکی مجهز است از رقیق‌ترین لوله مقداری برداشت کرده، در سطح پلیت در همان بخشی که با علامت رقت مربوط مشخص شده، دو قطره جدا از هم قرار می‌دهند. سپس بقیه را در لوله خودش خالی کرده، در لوله بعدی که حاوی نمونهی ۱۰ برابر غلیظ‌تر است سه بار پیپت را شسته، از آن برداشت می‌کنند و به همان ترتیب قبل دو قطره در بخش مربوط محیط کشت قرار می‌دهند. و به همین ترتیب تا کم‌ترین رقت (۱-۱۰) عمل می‌شود. پلیت را در حالی که درشان بسته است به همان وضعیت در گرمخانه قرار می‌دهند تا قطره‌های موجود در سطح محیط کشت خشک شوند. بعد آنها را به طور واژگون (به منظور جلوگیری از تداخل قطرات در یکدیگر) مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه در حرارت مناسب با نوع آزمایش قرار می‌دهند. پس از این مدت پلیت را که حاوی حداکثر ۲۰ پرگنه در هر قطره می‌باشد شمارش می‌کنند. پلیت ها دوباره به مدت ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری و پس از آن شمارش نمایند. این روش از نظر صرفه جویی در محیط کشت مناسب است و برای شمارش استافیلوکوک و باکتری‌های بی هوازی اختیاری مانند کلستریدیوم پرفرنژانس که مشخصات پرگنه در سطح محیط کشت در شمارش اهمیت دارد بکار می‌رود. می‌توان از محیط‌های اختصاصی مانند محیط بردپارکر برای استافیلوکوک و یا محیط ژلوز خون دار که سطح آن با نئومایسین آغشته شده برای کلستریدیوم پرفرنژانس استفاده نمود.
روش اتوماتیک: برخی کارخانجات محیط‌های کشت آماده را، در ظروف مخصوص تهیه کرده‌اند که با فرو بردن آنها در رقت معینی از نمونه و سپس قرار دادن در گرمخانه می‌توان با شمارش پرگنه های ظاهر شده، تعداد باکتری‌ها و حتی بعضی از انواع آنها را تشخیص داد. همچنین دستگاه‌های خودکاری ساخته شده که از نمونهی ماده غذایی رقت‌های مختلف (یک یا چند رقت) تهیه می‌کند و به وسیله‌ی سوزن مخصوص رقت تهیه شده را در سطح پلیت با روند گفته شده می‌گستراند که پس از گرمخانه گذاری با استفاده از جداول خاص و یا حتی با استفاده از دستگاه‌های مجهز به چشم الکترونیکی تعداد باکتری‌ها در نمونه بدست می‌آید. از دستگاه‌های مشابه کولتر کانتر (Coulter Counter) که در پزشکی برای شمارش گلبول‌های خون بکار می‌رود برای شمارش باکتری‌ها در مواد غذایی مانند شیر استفاده می‌شود.
کشت باکتری‌ها به کمک کاغذ صافی: کاغذهای صافی مخصوص میکروب¬شناسی در صنعت ساخته شده است که به دلیل داشتن منافذ بسیار ریز، میکروب‌ها را در خود نگه می‌دارند. از این کاغذ صافی‌ها برای سترون کردن مایعات و محلولهای مختلف حساس به حرارت استفاده می‌شود. بعضی از کارخانه‌های (کارخانه میلی پور آمریکا و سوتر آلمان) سازنده وسایل آزمایشگاهی از این نوع کاغذها با قیف‌های مخصوص که در برابر حرارت مقاوم‌اند و قابل سترون شدن می‌باشند برای شمارش و جست و جوی باکتری‌ها در آب و فرآورده‌های دارویی ساخته‌اند و حتی بعضی از سازندگان پلیت مخصوص که قطر آنها متناسب با کاغذهای صافی است و محیط‌های کشت آماده در آمپول‌های کوچک برای یک بار کشت و حتی گرمخانه‌های کوچک که با برق اتومبیل و یا با باتری کار می‌کنند برای عملیات صحرایی تهیه و عرضه کرده‌اند. از این صافی‌ها برای جستجو و شمارش میکروب‌ها در آب معدنی و دیگر آشامیدنی‌هایی که تعداد باکتری‌های آنها کم است و لازم می‌باشد که حجم زیادی از نمونه برای شمارش و جستجوی باکتری بکار رود استفاده می‌شود؛ به این ترتیب که مقدار کافی نمونه از صافی عبور داده می‌شود تا کلیه باکتری‌های موجود در آن حجم در منافذ کاغذ به دام بیفتند سپس کاغذ صافی روی محیط کشت جامد قرار داده می‌شود و در صورت لزوم ممکن است روی آن نیز با یک لایه‌ی نازک از محیط کشت مذاب که حرارت آن کمتر از C°۴۵ است پوشانده شود. سپس این ظرف گرمخانه گذاری شده پس از ۲۴ و ۴۸ ساعت تعداد پرگنه های مورد نظر شمارش می‌شود. اگر منظور فقط جستجوی یک نوع میکروب، مانند سالمونلا، در یک آشامیدنی مانند آب باشد می‌توان حجم مناسبی از نمونه را از کاغذ صافی گذرانید سپس کاغذ صافی را در محیط کشت مایع قرار داد و پس از گرمخانه گذاری از آن محیط برای جستجو و تشخیص میکروب مورد نظر استفاده نمود. از این روش در کارخانه‌های داروسازی برای کنترل سترونی محلولهای دارویی مانند محلولهای تزریقی استفاده می‌شود. همچنین این روش، در بهداشت محیط و کنترل آب و فاضلاب و بررسی‌های همه گیری شناسی بسیار ارزشمند می‌باشد.
۱- برداشتن صافی از روی دستگاه صاف کننده
۲- گذاشتن صافی روی تشتک ژلوزدار
۳- انتشار مایع به طرف صافی شکل
۲-۵- نمایش شمارش میکروارگانیسم‌ها به کمک صافی
١. شکل
٢. سطح
٣. لبه، کناره
شکل ۳- شکل کلنی‌ها روی محیط جامد
روش‌های تأمین شرایط بی هوازی
۱- استفاده از گرمخانه بی هوازی که در آن دمای مناسب رشد و شرایط بی هوازی هم زمان تأمین می‌شود این گرمخانه‌ها اکسیژن داخل محفظه را با پمپ خلأ خارج کرده و به جای آن گاز کربنیک یا ازت وارد می‌کنند.
۲- جار بی هوازی دو نوع شیشه‌ای و پلاستیکی دارد که نوع پلاستیکی بهتر است زیرا سبک بوده و نمی‌شکند. برای ایجاد شرایط بی هوازی در این بار از بسته‌های تولید کننده گاز (Gaspak) استفاده می‌شود که در بیشتر موارد تولید گاز هیدروژن می‌نماید که این گاز با اکسیژن داخل جار در حضور کاتالیزور پالادیوم ترکیب شده و تولید چند قطره آب می‌نماید.
برای تأیید شرایط بی هوازی درون جار از معرف استفاده می‌شود.
۳- استفاده از محیط‌های کشت احیاء کننده: در فرمول برخی از محیط‌های کشت مانند تیوگلیکولات براث ترکیباتی احیاکننده مانند سیستیئن و تیوگلیکولات وجود دارند که با اکسیژن محلول در آن واکنش داده و آن را از دسترس میکروب‌ها خارج می‌کنند.
مصرف بی هوازی شدن این نوع محیط‌های کشت متیلن بلو یا رزا زورین (Resozurin) می‌باشد.
۴- استفاده از دسیکاتور و شمع: در مواردی که به روش‌های یاد شده دسترسی نباشد می‌توان از یک دسیکاتور و شمع یا گاز یک برای ایجاد شرایط بی هوازی استفاده نمود. برای این منظور لازم است پلیت ها و لوله‌های کشت شده را داخل جار قرار داده روی آن یک شمع روشن قرار داده درب دسیکاتور را می‌بندیم. شمع در حال سوختن به تدریج بخش زیادی از اکسیژن داخل محیط را مصرف می‌کند چنانچه لازم باشد شرایط بی هوازی مطلق ایجاد شود لازم است از گاز پک استفاده شود.
شکل ۴- جار بی هوازی
روش کشت بی هوازی
۱- لوله‌های حاوی تیوگلیکولات جوشانده و سرد کرده را با میکروب بی هوازی تلقیح کنید.
۲- تمام کشت‌ها را در گرمخانه C° ۳۷ بگذارید. در وقت بعدی آزمایشگاه آنها را ملاحظه کنید. از روش گلوکز شیک برای بررسی کلنی‌های تولید شده استفاده کرده، محل تشکیل آنها را در لوله یادداشت کنید. آیا هیچ گونه نشانی از تولید گاز وجود دارد؟
شکل ۵- رابطه بین تراکم اکسیژن و رشد میکروب‌ها در محیط جامد
فکر کنید و پاسخ دهید:
۱- چرا اکسیژن محلول در آبگوشت تیوگلیکولات دار باعث وقفه در رشد میکروب‌های بی هوازی می‌شود؟
۲- آیا دو نوع از کلستریدیوم های مختلف، در یک محیط یکسان، به یک شکل رشد می‌کنند؟
۳- چه ماده‌ای را اکسید کننده‌ی قوی و چه ماده‌ای را احیا کننده قوی می‌نامند؟
۴- شرایط رشد باکتری‌های بی هوازی از نظر نیروی اکسیدوردوکسیون محیط چگونه است؟
روش شمارش مستقیم
از این روش به دلیل سرعت زیاد می‌توان در موارد فوری مانند تحویل گرفتن شیر در کارخانه‌ها استفاده نمود. البته دقت این روش به مراتب از روش‌های قبلی کمتر است.
الف) در روش شمارش مستقیم می‌توان از لام های مخصوص نئوبار (Neubar) و یا لام توما (Thoma) که برای شمارش گلبول‌های خون بکار می‌رود استفاده نمود. بدین ترتیب که نمونه مورد آزمایش به نسبت‌های معین با آب مقطر و یا سرم فیزیولوژی و یا هر رقیق کننده‌ی مناسب دیگر، رقیق می‌شود (برای واضح‌تر دیدن میکروارگانیسم‌ها به مایع رقیق کننده مواد رنگی نظیر متیلن بلو و یا ویوله ژانسین و یا رنگ دیگری افزوده می‌شود) بعد از رقت تهیه شده روی لام توما ریخته، یک لامل روی آن قرار می‌دهند. چند دقیقه صبر کرده، سپس در زیر میکروسکوپ با عدسی بزرگ نمایی ۴۰ میکروارگانیسم‌ها را در حجم معینی (۱/۰ میلی متر مکعب یا بیشتر) شمارش می‌کنند و با توجه به رقت نمونه- تعداد میکروارگانیسم‌ها در هر گرم و یا سانتی متر مکعب- بدست می‌آید.
ب) سوسپانسیونی از مخمر که در زیر میکروسکوپ به وضوح قابل تشخیص‌اند و در محلول‌ها به خوبی به حالت تعلیق در می‌آیند تهیه می‌شود و به روش فوق تعداد مخمرهای آن در میلی لیتر تعیین می‌گردد. سپس از این تعلیق با حجم مساوی به رقت‌های تهیه شده از نمونه غذایی می‌افزایند بنابراین در محلول به دست آمده تعداد مخمر یا دیاتمه به (یک دوم) تقلیل می‌یابد. حال اگر یک قطره از این محلول را در زیر میکروسکوپ قرار داده، در یک یا چند میدان تعداد مخمرها را بشمارند و تعداد میکروب‌ها را به دست آورند تعداد باکتری‌ها در ماده‌ی غذایی به دست می‌آید.
آزمون حرکت در باکتری
جهت آزمایش حرکت در باکتری‌ها بهتر است از کشت روی محیط نوترین برات یا آگار خوابیده در لوله به مدت ۱۸ ساعت استفاده شود.
برای این منظور لازم است از یک لام آزمایشگاهی مقعر یا توگود (Cavity slide) استفاده شود، نحوه انجام آزمون به این ترتیب است که یک قطره کوچک از رقت مناسب محتوی باکتری مورد آزمون را وسط یک لامل قرار داده و در چهار گوشه آن مقدار کمی وازلین گذاشته و آن را روی لام توگود قرار می‌دهیم به این ترتیب که قطره درست در وسط گودی لام قرار گیرد بعد مجموعه را زیر میکروسکوپ گذاشته یک قطره روغن سدر پشت لامل که زیر آن قطره قرار گرفته ریخته و با درشت نمایی ۱۰۰ مشاهده می‌کنیم در این آزمون باید از گرم شدن قطره جلوگیری شود تا حرکت ذرات محتوی مایع با حرکت باکتری اشتباه نشود.
خودآزمایی
۱- روش مناسب برای شمارش میکروارگانیسم‌ها کدام است؟ توضیح دهید.
۲- چگونه می‌توان با یک پیپت از کلیه‌ی رقتها، نمونه را به ظروف کشت منتقل کرد؟
۳- در روش شمارش استاندارد، درجه حرارت گرمخانه چگونه انتخاب می‌شود؟
۴- مدت گرمخانه گذاری برای باکتری‌ها و قارچ‌ها، پس از کشت، چگونه است؟ (در روش استاندارد)
۵- تفاوت روش شمارش سطحی و استاندارد را بیان کنید.
۶- مزایای روش شمارش قطرهای میکروارگانیسم‌ها چیست؟
۷- روش شمارش باکتری‌ها با کاغذ صافی چه مزایایی دارد و بیشتر در چه مواردی به کارمی‌رود؟
۸- روش مستقیم شمارش میکروارگانیسم‌ها را در مورد باکتری‌ها و مخمرها شرح دهید.
۹- کلیه‌ی روش‌های شمارش میکروارگانیسم‌ها را نام ببرید.
۱۰- چگونه می‌توان با جوشاندن محیط کشت اکسیژن آن را خارج نمود؟
۱۱- آیا می‌توانید به کمک یک شمع محیط بسته‌ای را فاقد اکسیژن نمایید؟ چگونه؟
۱۲- مراحل کشت بی هوازی باکتری‌ها را شرح دهید.
