تکنولوژی زیستی؛ روش‌ها و ابزارهای مهندسی ژنتیک؛ مراحل مهندسی ژنتیک

تکنولوژی زیستی

ژل انگشت‌نگاری DNA

یک قطره خون برای تعیین نقشه ژنی یک فرد کافی است. تکنولوژی ژن در همان حال که می‌تواند خدمات زیادی به جامعه بشری ارائه دهد، مشکلاتی را نیز ممکن است به دنبال داشته باشد.

پیش نیازها

پیش از مطالعه این مطلب باید بتوانید:

 ژن را تعریف کنید،

 ساختار DNA را شرح دهید،

 زوج شدن بازهای مکمل و نقش آنها را در ژنتیک بیان کنید.

 مهندسی ژنتیک

تا چندی پیش، فکر استفاده از باکتری‌ها برای تولید انسولین انسانی و وارد کردن ژن به سلول‌های گوجه فرنگی و انسان فقط در فیلم‌ها و کتابهای علمی – تخیلی یافت می‌شد؛ اما اکنون روش‌های لازم برای تحقق این اندیشه‌ها به وجود آمده، توسعه یافته و کاربرد روزانه پیدا کرده است.

در سال ۱۹۷۳ دو فرد به نام‌های استانلی کوهن و هربرت بایر آزمایشی طراحی و اجرا کردند که به این اندیشه‌ها جامه عمل پوشاند و پژوهش‌های ژنتیک را متحول کرد. آنان ژن رمزکننده RNA ریبوزومی (rRNA) را از DNA نوعی قورباغه افریقایی استخراج و به DNA باکتری اشریشیاکلای وارد کردند (شکل ۱).

شکل ۱- ایجاد تغییر در ژن‌های یک موجود زنده. کوهن و بایر اولین جانداری را که از طریق مهندسی ژنتیک تغییر یافته بود، تولید کردند.

باکتری هنگام رونویسی، rRNA قورباغه را نیز می سازد؛ باکتری اشریشیاکلای اولین جانداری است که با روش‌های مهندسی ژنتیک تغییر پیدا کرد و به اصطلاح تحت دست ورزی قرار گرفت. فرآیند دست ورزی در ژنها، مهندسی ژنتیک نامیده می‌شود.

در مهندسی ژنتیک اهداف مختلفی دنبال می‌شود. اما یکی از مهم ترین آنها تولید ژن یا فراورده آن به مقدار انبوه است. برای تولید ژن به مقدار انبوه، مهندسان ژنتیک، ژن مورد نظر را از میان انبوه ژن‌های جاندار جدا و بعد آن را به جاندار ساده‌ای مثل باکتری – که تولید مثل سریعی دارد – وارد می‌کنند. به این ترتیب، ژن مورد نظر در باکتری همانندسازی می‌کند و در نتیجه همانندسازی‌های پی در بی، مقدار آن زیاد می‌شود. در این فرآیند مهندسان ژنتیک به ابزارهایی نیاز دارند. آنان نخست باید بتوانند ژن موردنظر را از بقیه DNA جاندار جدا کنند. پس به ابزاری نیاز دارند که بتواند DNA را ببرد. برای بریدن DNA از آنزیم‌هایی به نام آنزیم‌های محدود‌کننده استفاده می‌کنند که با آنها آشنا خواهیم شد. آنان سپس به وسیله‌ای نیاز دارند که ژن موردنظر را به درون باکتری حمل کند. به نظر شما، مهندس ژنتیک به چه وسایل دیگری نیاز دارد؟ (شکل ۲)

شکل ۲- در بسیاری از آزمایش‌های مهندسی ژنتیک یکی یا همه این مراحل اساسی انجام می‌شود.

روش‌ها و ابزارهای مهندسی ژنتیک

وکتورها: بعد از آن که ژن موردنظر را جدا کردیم، به وسیله‌ای نیاز داریم که آن را به درون سلول باکتری هدایت کند. این وسیله را حامل یا وکتور می‌نامند. از معمول ترین وکتورها، پلازمیدها و ویروسها را می‌توان نام برد.

پلازمیدها، مولکول‌های DNA حلقوی کوچکی هستند که در بعضی از باکتری‌ها وجود دارند. پلازمیدها را کروموزوم‌های کمکی نیز می‌نامند، چون حاوی ژن‌هایی هستند که در کروموزوم اصلی باکتری وجود ندارد. مثلا ژن مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک در پلازمیدها قرار دارد.

پلازمیدها می‌توانند مستقل از کروموزوم اصلی همانندسازی کنند. معنی این جمله آن است که پلازمیدها می‌توانند حتی در مواقعی که باکتری در حال تولید مثل نیست نیز همانندسازی کنند. مهندسان ژنتیک، ژن مورد نظر را درون پلازمید قرار می‌دهند. به این ترتیب، هرگاه که پلازمید همانند سازی می‌کند، ژن موردنظر نیز همانند سازی می‌کند و بدین ترتیب بر تعداد نسخه‌های آن دائما افزوده می‌شود.

وقتی ژن موردنظر، که از این پس آن را ژن خارجی می‌نامیم، درون پلازمید قرار می‌گیرد، در واقع DNA جدیدی ساخته می‌شود که از ترکیب دو DNA متفاوت، یکی ژن خارجی و دیگری پلازمید، حاصل شده است. این DNA را DNA نوترکیب می‌نامند. ساختن DNA نوترکیب، یکی از اصلی ترین مراحل مهندسی ژنتیک است. از این رو مهندسی ژنتیک را فناوری DNA نوترکیب نیز می‌نامند.

از دیگر وکتورها می‌توان به باکتریوفاژها اشاره کرد. باکتریوفاژها، ویروسهایی هستند که میزبان آنها باکتری است. وقتی باکتریوفاژ، باکتری را آلوده می‌کند، DNA آن در سلول میزبان شروع به همانندسازی می‌کند. با قرار دادن ژن خارجی در DNA باکتریوفاژ، امکان تکثیر ژن فراهم می‌شود.

ساختن مولکول DNA نوترکیب: برای ساختن مولکول DNA نوترکیب، به دو نوع آنزیم نیاز داریم. یکی برای بریدن پلازمید و قرار دادن ژن خارجی در آن و دیگری برای اتصال دو سر ژن خارجی به پلازمید. توجه داشته باشید که منظور از بریدن DNA یعنی قطع پیوند فسفودی استر و منظور از اتصال دو DNA یعنی برقراری پیوند فسفودی استر میان دو DNA است.

بریدن DNA، به کمک آنزیم‌های محدود‌کننده صورت می‌گیرد. آنزیم‌های محدود‌کننده آنزیم‌هایی باکتریایی هستند که توالی کوتاه و خاصی از DNA را شناسایی می‌کنند و سپس آن را برش میدهند.

مثالی از چگونگی عمل آنزیم‌های محدود‌کننده در شکل ۳ نشان داده شده است. آنزیم محدود‌کننده EcoRI توالی نوکلئوتیدی (GAATTC@CTTAAG) را می‌شناسد. توالی خاصی که آنزیم آن را می‌شناسد، جایگاه تشخیص آنزیم نام دارد. توجه داشته باشید که توالی دو رشته جایگاه تشخیص عکس یکدیگر هستند.

بیشتر آنزیم‌های محدود کننده، قطعاتی از DNA کوتاه تک رشته‌ای در هر دو انتها تولید می‌کنند که با یکدیگر مکمل هستند. این دو انتها انتهای چسبنده نامیده می‌شوند. همان طور که در شکل ۳ نشان داده شده است، وکتورهای به کار برده شده، فقط دارای یک جایگاه تشخیص آنزیم هستند. آنزیم محدود‌کننده‌ای که برای بریدن پلازمید استفاده می‌شود، باید همان آنزیمی‌باشد که دو سر ژن خارجی با آن بریده شده است. در این صورت، انتهای چسبند؛ یکی به انتهای چسبنده دیگری متصل می‌شود. این اتصال، توسط پیوندهای هیدروژنی صورت می‌گیرد نه پیوند فسفودی است. برای برقراری پیوند فسفودی استر میان دو DNA، مهندسان ژنتیک از آنزیمی‌به نام آنزیم لیگاز استفاده می‌کنند (شکل ۳).

شکل ۳- آنزیم‌های محدود‌کننده DNA را برش می‌دهند. آنزیم محدود کننده EcoRI توالی نوکلئوتیدی GAATTC را می‌شناسد و آن را برش می‌دهد. این برش بین نوکلئوتیدهای G و A است.

کلون شدن ژن: بعد از آن که DNA نوترکیب ساخته شد، آن را در مجاورت باکتریها قرار می‌دهند تا باکتریها آن را جذب کنند. البته همه باکتری‌ها موفق به جذب DNA نوترکیب نمی‌شوند، اما تعداد کمی از آنها DNA نوترکیب را جذب می‌کنند. DNA نوترکیب بعد از ورود به باکتری، با استفاده از دستگاه همانندسازی باکتری، همانندسازی می‌کند و در نتیجه همانندسازی‌های پی درپی DNA نوترکیب نسخه‌های متعددی از آن و در نتیجه ژن خارجی ساخته می‌شود. وقتی از یک ژن نسخه‌های یکسان متعدد ساخته می‌شود، می‌گویند آن ژن، کلون شده است.

غربال کردن: در این مرحله، مهندسان ژنتیک باید باکتری‌هایی را که DNA نوترکیب را جذب کرده‌اند از باکتری‌هایی که DNA نوترکیب را جذب نکرده‌اند، جدا کنند. این کار را غربال کردن می‌نامند. به یاد داشته باشید که پلازمید، حاوی ژن مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک است. بنابراین، آنهایی که DNA نوترکیب را جذب کرده‌اند، نسبت به یک آنتی بیوتیک خاص – مثلا تتراسایکلین – مقاوم شده‌اند. به این ترتیب، می‌توان با اضافه کردن تتراسایکلین به محیط کشت باکتریها، غربالگری را انجام داد. باکتریهایی که DNA نوترکیب را جذب نکرده‌اند، بعد از اضافه کردن تتراسایکلین می‌میرند و فقط آنهایی زنده می‌مانند که DNA نوترکیب را جذب کرده‌اند (شکل ۴).

شکل ۴- غربال کردن. فقط سلول‌هایی که وکتور را جذب کرده‌اند، نسبت به تتراسایکلین مقاوم اند و بنابراین وقتی تتراسایکلین به آنها اضافه شود، زنده می‌مانند.

استخراج ژن: اکنون نوبت به استخراج ژن می‌رسد. ژن باید از DNA نوترکیب جدا شود. برای جدا کردن ژن، باز هم به آنزیم محدود‌کننده نیاز داریم. باید از همان آنزیمی استفاده کنیم که قبلا برای ساختن DNA نوترکیب استفاده کردیم. با این آنزیم، پلازمید و ژن خارجی را از یکدیگر جدا می‌کنیم. حال در لوله آزمایش، مخلوطی داریم از دو نوع DNA: یکی پلازمید و دیگری ژن خارجی. تفکیک این دو به کمک الکتروفورز در ژل انجام می‌شود. ژل، ورقهای مستطیلی شکل ژلاتینی است. در ژل، منافذ ریز بسیاری وجود دارد. در یک سمت ژل، چاهکهایی وجود دارد که مخلوط مولکول‌های DNA در آن قرار می‌گیرد. یک میدان الکتریکی از درون ژل می‌گذرد. از آنجا که مولکول‌های DNA بار منفی دارند، پس از برقرار شدن میدان الکتریکی، به سمت قطب مثبت میدان حرکت می‌کنند. در حین حرکت، از منافذ موجود در ژل عبور می‌کنند. مولکول‌های کوچکتر، سریع‌تر از منافذ عبور می‌کنند و جلوتر از بقیه حرکت می‌کنند. به این ترتیب، DNAها از یکدیگر جدا می‌شوند و مولکول‌هایی که به یک اندازه هستند در یک ردیف قرار می‌گیرند و به این ترتیب موقعیت آنها در ژل به صورت نوارهایی مشاهده می‌شود. بنابراین، بعد از اتمام الکتروفورز مخلوط دو نوع DNA پلازمیدی و خارجی، دو نوار در ژل خواهیم دید. نواری که به قطب مثبت نزدیک‌تر است، حاوی مولکول‌های کوچک‌تر یعنی DNA خارجی است و نوار دیگر حاوی مولکول‌های بزرگ تر، یعنی پلازمید است. روش الکتروفورز علاوه بر نوکلئیک اسیدها، برای پروتئین‌ها نیز کاربرد دارد. در این روش، پروتئینها براساس اندازه، از یکدیگر جدا می‌شوند.

خودآزمایی

١- چهار مرحله عمومی آزمایش‌های مهندسی ژنتیک را برای شرح کلون کردن یک ژن انسان، به کار برید.

۲- نقش «انتهای چسبنده» DNA را در ساختن DNA نوترکیب شرح دهید.

٣- به طور خلاصه شرح دهید چگونه سلول‌ها در آزمایش‌های مهندسی ژنتیک غربال می‌شوند.