روش‌های تعیین تعداد باکتری‌ها؛ تأثیر عوامل محیطی بر کشت باکتری‌‌ها

سنجش میزان رشد میکروارگانیسم‌ها

سنجش میزان رشد میکروارگانیسم‌ها

عملا در هر مرحله از میکروبیولوژی، برای اندازه گیری رشد میکروب‌ها به روش‌هایی نیاز است. در این مورد تعداد سلول‌ها و یا تودهی سلول‌ها اندازه گیری می‌شود. روش‌هایی که تعداد سلول‌ها را تعیین می‌کند به خصوص برای شمارش موجودات تک سلولی مثل باکتری‌ها و مخمرها قابل استفاده می باشد. در حالی که روش اندازه گیری توده سلول‌ها را می‌توان برای تمام انواع میکروب‌ها از جمله انواع رشته دار بلند مثل کپکها که نمی‌توان آنها را با روش تعیین تعداد سلول‌ها اندازه گرفت به کار برد. معمول ترین روش اندازه گیری تعداد سلول‌ها روش پلیت یا شمارش کلنیهاست. این روش بر اساس فرضیه ایست که طبق آن یک سلول باکتری ایجاد یک کلنی کرده، در نتیجه تعداد کلنی‌های تشکیل شده روی پلیت ژلوز معادل تعداد باکتری‌های اصلی است. در شمارش با رقت، (Dilution Count) یک سری نمونه با رقت‌های متفاوت تهیه کرده، آنها را در یک سری لوله حاوی محیط مایع – به جای کشت در پلیت – تلقیح می‌کنیم. پس از قرار دادن در گرم خانه تمام لوله‌های حاوی سلول، به دلیل تکثیر میکروب‌ها، کدر خواهد شد و بعضی از لوله‌ها با رقت زیاد ممکن است شفاف باشند. دلیل این امر، آن است که در نمونه‌ی تلقیحی هیچ گونه باکتری زنده‌ای وجود نداشته است. از رقیق ترین نمونه‌ای که در آن تکثیر صورت گرفته است تعداد میکروب‌ها اندازه گیری می‌شود. در آزمایش برای تعیین تعداد باکتری‌ها در نمونه‌های آب، روش و شمارش با رقت تغییر یافته‌ای را به کار خواهید برد. همین طور، برای شمارش کلنی‌ها می‌توان از صافی‌های غشایی استفاده کرد. با عبور دادن یک نمونه از درون صافی غشایی گیرنده باکتری ها، می‌توانید سلول‌ها را در سطح صافی به دست آورید. سپس با به کار بردن یک محیط کشت مناسب، سلول‌ها روی سطح صافی رشد کرده، تعداد کلنی‌های حاصل نشان دهنده تعداد باکتری هاست. استعمال صافی‌های غشایی در تعیین باکتریهای مدفوع در آب می باشد. در این روش‌های کشت سلولهای زنده‌ای که در محیط‌های آماده شده تکثیر می یابند اندازه گیری می‌شوند. تعدادی روش‌های دیگر وجود دارد که می‌توان در آنها مستقیما تمام سلولهای زنده و مرده‌ی نمونه را اندازه گیری کرد. این روش‌های مستقیم ارزش روش‌های کشت را ندارند، ولی وقت کمتری می‌گیرند. یکی از معمول ترین این روش‌ها عبارتست از شمارش مستقیم میکروسکوپی، که در آن حجمی معین از یک نمونه را روی یک سطح معین لام پخش می‌کنند. با شمارش میکروب‌ها در یک سطح مشخص و ضرب آن در ضریب مخصوص، می‌توانید تعداد میکروب‌های نمونه‌ی اصلی را محاسبه کنید. برای راحت کردن عملیات، لام‌های مخصوصی برای شمارش وجود دارد (برای مثال لام پتروف – هازر (Petroff – Hauser slide) ) که دارای یک گودی با عمق و حجم مشخص است، و به مربعهایی تقسیم شده است. تعداد میکروب‌ها در یک حوزهی معین (مثلا در ۵۰ یا ۱۰۰ مربع) شمارش شده، با در نظر گرفتن این که نسبت حجم کلی به حجم محاسبه شده معین است می‌توان تعداد کل باکتری‌ها را در نمونه محاسبه کرد. در روش برید (Breed)، حجمی معین از نمونه را در یک سطح یک سانتی متر مربعی لام پخش کرده، آن را خشک و تثبیت و رنگ می‌کنند. بعد تعداد میکروارگانیسم‌ها را در حوزههای متعدد میکروسکوپی تعیین می‌کنند. از آنجایی که مساحت حوزه میکروسکوپی مشخص است، شمارش باکتری‌ها را می‌توان محاسبه کرد. روش برید را برای تعیین تعداد باکتری‌های شیر در آزمایش به کار خواهید برد. نمونه‌ای از لامهای مدرج شمارش میکروارگانیسم‌ها در شکل ۱-۷ مشخص شده است. سلول‌ها و عناصر دیگر را می‌توان به وسیله‌ی الکترونیکی هم محاسبه کرد. در شمارشگر کولتر (Coulter Counter) نمونه‌ای را از یک سوراخ کوچک عبور داده، از روی تغییری که در مقاومت الکتریکی ایجاد می‌شود، نه تنها تعداد عناصر، بلکه اندازهی آنها را هم می‌توان مشخص کرد. به هر حال چون این روش تمام عناصر یک نمونه را اندازه می‌گیرد، فقط برای سوسپانسیون‌های آبی میکروب‌ها قابل استفاده است و نمی‌توان آن را برای تعیین تعداد مثلا میکروارگانیسم‌ها در خاک به کار برد. در اندازه گیری تودهی سلولی یک کشت میکروبی مقدار کل پروتوپلاسم سلولی در میلی لیتر محیط کشت محاسبه می‌شود. برای تعیین توده‌های سلولی، معمول ترین روش‌ها عبارت است از: ۱- انتشار نور یا روش‌های کدورت سنجی، ۲- اندازه گیری شیمیایی محتویات سلولی، ۳-روش‌های وزن خشک و ۴- روش‌های حجم سلولی.

روش‌های کدورت سنجی (Turbidimetric)، اغلب در اندازه گیری توده سلولی به کار می رود. این روش‌ها بر این واقعیت بنا شده است که سلول‌های یک محیط کشت مایع بر حسب تودهی کل آن در کشت مانع از عبور نور می‌شوند یا آن را پخش می‌کنند. سنجش شیمیایی، تودهی سلولی به وسیله‌ی اندازه گیری مقدار بعضی از محتویات مخصوص سلول‌ها مثل، ازت سلولی، پروتئین، فسفر یا DNA، انجام می‌شود. در شرایط استاندارد مقدار این مواد می‌تواند یک سنجش دقیق از پروتوپلاسم محیط کشت به دست دهد. وزن خشک، سلول‌ها یا میسلیوم‌ها(Mycelium)ی حجم معینی از محیط کشت می‌تواند مشخص کننده‌ی مقدار توده سلولی باشد. برای چنین سنجشی، کشت میکروبی به وسیله‌ی سانتریفوژ یا صاف کردن جمع آوری شده، سلولها شسته، بعد از خشک کردن وزن آنها اندازه گیری می‌شود. حجم سلولی، با قرار دادن مقدار استاندارد یک محیط کشت در لوله سانتریفوژ مدرج و اندازه گیری حجم مرطوب ته نشین بعد از سانتریفوژ سنجیده می‌شود.

روش‌های کمی‌کشت روی پلیت در آزمایش برای جدا کردن باکتریها، کشت روی پلیت را به کار بردید و دیدید که هر سلول باکتری زنده یک کلنی قابل رؤیت از سلول‌های دختر را تشکیل می دهد. از آنجا که هر سلول باکتری یک کلنی تشکیل میدهد، می‌توانید از کشت روی پلیت برای تعیین شماره‌ی باکتریها در یک ماده مثل یک نمونه آب استفاده کنید. برای شمارش باکتریها نمونه را رقیق کرده، روی پلیت کشت می دهند، و بعد از قرار دادن در گرمخانه، کلنیهای ایجاد شده را می‌شمارند. پس از آن، تعداد باکتری‌های نمونه‌ی اصلی را با ضرب کردن تعداد کلنیهای تشکیل شده در درجه رقت (ضریب رقت) پلیت مخصوصی که شماره شده است تعیین می‌کنند. رقت را اغلب اوقات با علامت منفی نشان می دهند. برای مثال، به جای ۱۰۰۰۰۰، ۱۰۵ بکار برده می‌شود. برای رقیق کردن کمی یک نمونه، اغلب یک گرم یا یک میلی لیتر نمونه با یک سری لوله آزمایش یا بطری‌هایی که حاوی مقدار معینی آب استریل یا محلول تامپون است به تدریج رقیق می‌شود. در این آزمایش یک میلی لیتر از نمونه‌ی آب را به ۹۹ میلی لیتر آب استریل اضافه کرده، در نتیجه دارای رقت یک صدم از نمونه اصلی خواهید شد. با ادامه‌ی تدریجی این عمل یعنی با بکار بردن بطری‌های اضافی برای عمل رقیق کردن، می‌توانید نمونه‌هایی با رقت ۱۰۴، ۱۰۶ و غیره بدست آورید. سپس، با کشت دادن یک میلی لیتر و ۱/۰ میلی لیتر از هر کدام از رقتها می‌توانید پلیت‌هایی با رقت ۱-۱۰، ۲-۱۰، ۳-۱۰، ۴-۱۰ و بیشتر به دست آورید.

روش کار:

دو نمونه آب الف وب فراهم شده است. نمونه‌ی الف دارای کیفیتی خوب و حاوی تعداد کمی باکتری است. نمونه‌ی ب نمونه‌ای ناخالص است که حاوی مقدار زیادی باکتری است. بنابراین برای تهیه پلیت‌های قابل شمارش باید بیش از نمونه الف رقیق شود.

شکل ۱- لام‌های مخصوص مدرج شمارش میکروب‌ها که اسامی مختلفی دارند (روش مستقیم شمارش) و برای تعیین افزایش تعداد میکروارگانیسم‌ها در هر میلی لیتر به کار می روند.

شکل ۲- نخستین کشت در پلیت به وسیله‌ی پیپت

در شروع کار، پلیت‌های پتری و نمونه‌های آب را مرتب کنید. پلیت‌ها و نمونه‌های آب را بر حسب رقت آنها علامت گذاری نمایید. همین طور پلیت‌هایی را هم که ممکن است ضروری باشد علامت گذاری کنید و رقت‌های دلخواه را تهیه کنید. دقت کنید که برای هر رقت پیپت عوض شود.

١- پنج لوله حاوی ژلوز غذایی را ذوب کنید (در هرکدام ۱۵ میلی لیتر). آنها را تا ℃۴۵ خنک کنید و تا هنگامی‌که رقتها تهیه می‌شوند آنها را برای مصرف آماده نگهدارید. فاصله‌ای که نمونه‌ها را در پلیت‌های پتری می ریزند تا موقعی که آنها را با ژلوز مخلوط می‌کنید، نباید بیش از چند دقیقه باشد. ۲- با یک پیپت استریل، ۱/۱ میلی لیتر از نمونه‌ی الف را برداشته و ۱/۰ میلی لیتر آن را در یک پلیت پتری استریل بریزید. یک میلی لیتر نمونه‌ی باقی مانده را در یک پلیت پتری استریل دیگر بریزید. پلیت اول را با الف ۱-۱۰ و پلیت دوم را با الف – ۱ علامت گذاری کنید.

٣- نمونه‌ی ب را که حاوی مقادیر زیادی باکتری است نمی‌توان به طور مستقیم آن طور که در مورد نمونهى الف عمل شده کشت داد، بلکه باید آن را با آب استریل رقیق کرد. با یک پیپت استریل یک میلی لیتر از نمونه‌ی ب را برداشته، آن را با ۹۹ میلی لیتر آب مخلوط کنید. چنین مخلوطی حاوی یک میلی لیتر از نمونه‌ی اصلی است که ۱۰۰ بار رقیق شده است، بنابراین یک میلی لیتر از این محلول رقیق شده معادل ۰۱/۰ میلی لیتر از نمونه اصلی می باشد.

۴- بطری حاوی مخلوط میکروبی را ۲۵ دفعه به شدت تکان دهید، به طوری که مچ دستتان در یک قوس حدود ۷۵ سانتیمتر حرکت کند. این عمل برای این است که اختلاط یکسانی در نمونه ایجاد شده، باکتری‌هایی که ممکن است به صورت چسبیده به هم و معلق باشند از یکدیگر جدا شوند.

۵- با یک پیپت استریل دیگر، مقدار ۱/۱ میلی لیتر از بطری حاوی نمونه‌ی رقیق شده (با رقت ۲-۱۰) را برداشته و مقدار ۱/۰ میلی لیتر آن را در یک پلیت پتری استریل (با رقت ۳-۱۰ نسبت به نمونهی اصلی) بریزید و روی آن را باب ۳-۱۰ علامت گذاری کنید. یک میلی لیتر باقی مانده را در یک پلیت پتری استریل دیگر ریخته (با رقت ۲-۱۰ نسبت به نمونه‌ی اصلی)، آن را باب۲-۱۰ علامت گذاری کنید.

۶- با همان پیپت قبلی یک میلی لیتر از بطری حاوی محلول با رقت ۱/۱۰۰ را برداشته، آن را با ۹۹ میلی لیتر آب مقطر مخلوط کنید. مخلوط را به همان شکلی که قبلا شرح داده شد ۲۵ دفعه تکان داده، یک میلی لیتر از این نمونه مخلوط شده را بردارید و در یک پلیت پتری بریزید. این پلیت را با ب ۴-۱۰ علامت گذاری کنید.

۷- ژلوزذوب و سرد شده را وارد پلیتهای پتری کرده، نمونه را به طور کامل با ژلوز مخلوط کنید. یکی از بهترین راه‌ها برای اختلاط نمونه و ژلوز عبارتست از کج کردن ملایم پلیت به طوری که ژلوز و نمونه چندین بار در اطراف پلیت به حرکت درآیند. دقت کنید که ژلوز روی لبه پلیت ریخته نشود.

۸- پلیت‌های پتری را در یک سطح صاف قرار دهید. پس از سرد شدن، آنها را به طور وارونه در گرمخانه ℃۳۰ قرار دهید.

۹- در پلیت‌هایی که در آنها تعداد کلنیها بین ۳۰ تا ۳۰۰ می باشد شمارش کلنی کنید.

پلیت‌های شمارش، کلنیهای تشکیل شده در پلیتهای ژلوزه را می‌توان در دستگاه‌هایی مثل شمار گر کلنی کبک (Quebec) که در آن یک منبع نورانی غیر مستقیم و یک ذره بین تعبیه شده است، شمرد. پلیت را به طور وارونه روی شمارگر قرار دهید. برای ممانعت از دوباره شمردن کلنیها، هر کلنی شمرده شده را با یک مداد چرب یا قلم در روی پلیت علامتگذاری کنید. اگر پلیت‌های زیادی را باید شماره کرد، ماشین حساب می‌تواند مفید باشد. کلنی‌هایی که به نام کلنیهای پخش (Spreader) خوانده می‌شوند، اغلب در لایه‌ی مرطوب سطح ژلوز یا بین ژلوز و ته پلیت پتری تشکیل می‌شوند. اگر کلنیهای پخش بزرگ هستند و سایر کلنیها را می پوشانند، پلیت را دور بریزید. غالبأ کلنیهای پخش کوچک، خاکستری و نازک هستند. اگر این کلنیها کوچک و مشخص باشند می‌توان آنها را به عنوان یک کلنی مجزا شماره کرد.

محاسبه شمارش پلیتها

تعداد باکتری‌ها در میلی لیتر نمونه اصلی (که شمارش پلیت می باشد) به وسیله‌ی ضرب کردن تعداد کلنی‌ها در درجه رقت به دست می آید. برای مثال، اگر در پلیت با رقت ۳-۱۰ تعداد ۱۵۰ کلنی شمردید، می‌توانید چنین محاسبه کنید ۱۵۰۰۰۰ = ۱۰۰۰×۱۵۰ یعنی در هر میلی لیتر نمونه‌ی اصلی ۱۵۰۰۰۰ باکتری وجود دارد. معمولا پیشنهاد می‌شود که برای هر رقت دو پلیت تهیه شود. از شمارش پلیتهای دوگانه معدل گرفته، بدین طریق به تعداد واقعی کلنیها نزدیک تر خواهد بود. میانگین ۱۴۸ و ۱۵۴ در دقت ۳-۱۰ عبارتست از ۱۵۱ و ۱۵۱۰۰۰ باکتری در میلی لیتر گزارش داده میشود. افزایش تعداد باکتریها در هر میلی لیتر در واحد زمان و در ساعت‌های متمادی که از نمونه برداشت می‌شود، می‌تواند مبین میزان رشد باکتری در زمان باشد.

فکر کنید و پاسخ دهید:

۱- چرا فقط پلیت‌هایی که بین ۳۰ تا ۳۰۰ کلنی دارند شمارش می‌شوند؟

۲- آیا کلنیهای توده‌های مجتمع باکتری بهتر از سلول¬های تک، تشکیل می‌شوند؟

٣- چرا بین رقت‌ها باید پیپتها عوض شود؟

تأثیرات محیطی

میکروب ها، شبیه تمام جانداران عمیقا تحت تأثیر محیط اطراف خود هستند. عوامل محیطی به سه دسته کلی تقسیم می‌شوند: فیزیکی (اثرات حرارت یا فشار قوی)، شیمیایی (احتیاج به غذاها و عکس العمل در برابر سموم) و بیولوژیکی (در اساس شیمیایی مثل اثرات متقابل انواع مختلف موجوداتی که با همدیگر زندگی می‌کنند. برای هر نوع میکروبی مانند هر نوع گیاه یا حیوان، شرایط محیطی مناسب ویژه‌ای وجود دارد، ولی به طور کلی حدود تحمل سلسله میکروب‌ها، نسبت به جانداران عالی بیشتر است. مثلا بدن انسان دارای یک حرارت طبیعی ℃۳۷ (۶/۹۸ درجه فارنهایت) است که به دقت تنظیم یافته، می‌تواند به رغم حرارت و یا سرمای شدید ثابت بماند. سلول باکتری دارای حرارت تنظیم یافته بدنی نیست، بلکه درجه حرارت محیط خارج را می پذیرد. عکس العمل باکتری در برابر سرما و یا خشکی زیاد فقط وقفه فعالیت‌های آنزیمی است، و بر خلاف جانداران عالی تر الزام نمی میرد. اگرچه اکثریت اشکال میکروبی به همان شرایطی نیاز دارند که برای سلول بیشتر گیاهان و حیوانات نافع است، ولی میکروارگانیسم‌هایی را یافته اند. (افراطی) که می‌توانند (و یا حتی احتیاج دارند) در شرایطی که نسبت به استانداردهای طبیعی نامناسب هستند زنده بمانند. در تمام گروه‌های بزرگ سلولی تنها سلول‌هایی به وسیله‌ی محیط انتخاب می‌شوند که می‌توانند به زندگی خود در شرایط تحمیل شده ادامه دهند. ولی حتی میکروب‌ها هم نمی‌توانند با دو دشمن کشنده موجودات زنده – حرارت شدید و بعضی سموم شیمیایی – سازگار شوند. هر دوی این نیروها، آنزیم‌ها و سایر پروتئین‌ها را که بدون وجود آنها زندگی نابود می‌شود، هدف قرار می دهند. در جدال دائمی بشر برای کنترل میکروارگانیسم‌های مضر و مفید، قوی ترین وسیله، کنترل عوامل محیطی میکروب‌ها بوده است. بشر برای حفاظت مواد مختلف در مقابل رشد میکروب‌ها، از حرارت، فشار اسمزی و کمبود اکسیژن استفاده کرده است، ولی همانطور که انتظار می رود، کنترل میکروارگانیسم‌ها به دلیل قدرت زیاد سازگاری و قابلیت تغییر شدید آنها دشوار است.

نوشابه‌های تخمیری

تخمیر نه تنها می‌تواند باعث نگه داری بعضی از غذاها شود، بلکه در موارد دیگر طعم و ارزش غذایی بعضی از آنها را بهبود می بخشد. بیشتر غذاهای تخمیری به رشد و فعالیت یک یا چند گونه از باکتری‌های اسید لاکتیکی، و یا مخمرها و یا ترکیب این دو نیاز دارند. نوع تخمیری که در یک غذا صورت می‌گیرد در درجه اول، با محتوای کربوهیدرات و pH آن معین می‌شود. وجود کربوهیدرات‌ها، اسیدیته بالا و ضعیف بودن غذاهای تامپونه باعث می‌شوند که عمل تخمیر الکلی به وسیله‌ی مخمرها صورت گیرد، در حالی که وجود کربو هیدراتها، اسیدیته پایین و وجود غذاهای تامپونه قوی باعث می‌شود که تخمیر اسید لاکتیکی انجام شود. در این آزمایش به بررسی میکروفلور بعضی از غذاهای تخمیری می پردازیم.

روش کار: (باترمیلک (Buttermilk) کشت شده)

باترمیلک کشت شده عبارتست از دوغ یا پس آب کره که به وسیله‌ی باکتری‌های اسید لاکتیکی تخمیر شده، در نتیجه در آن اسیدلاکتیک و مواد فرار تولید می‌شود. این عمل باعث انعقاد شیر می‌شود و به همراه آن بو و طعم مطبوعی در شیر ایجاد می‌گردد. به علت عدم دسترسی به باترمیلک برای تهیه آن شیر بدون چربی یا کم چربی را با مخلوطی از کشت باکتریهای اسید لاکتیکی که به نام باکتری‌های آغازگر(Starter) خوانده می‌شود مخلوط می‌کنند. در نتیجه‌ی این عمل، شیر ترش خواهد شد. هنگامی‌که در کشت در حدود ۸/۰ تا ۹/۰ درصد اسید لاکتیک ایجاد شد، عمل تخمیر را با سرد کردن کشت متوقف کرده با حرکت، لخته‌های شیر منعقده را خرد می‌کنند. باکتری‌های آغاز گر تجارتی، معمولا شامل استرپتوکوکوس لاکتیس(Streptococcus Lacteis) ، لوکونوستوک دکسترانیکوم (Leuconostoc Dextranicum) و لوکونوستوک سیترووروم (Leuconostoc Citrovorum) هستند. میکروب‌های مختلف گونه لوکونوستوک اسید سیتریک شیر را تجزیه کرده، دی استیل (Diacety1) تولید می‌کنند که قسمتی از بوی مشخص شیر تخمیر شده مربوط به آن است.

۱- یک لوله بزرگ و یا یک فلاسک شیر بدون چربی پاستوریزه را با ۰۱/۰ حجم خود، از کشت خمیر مایه (از ماست پاستوریزه تازه به عنوان استارتر می‌توان استفاده کرد که در این صورت دمای انکوباسیون ℃۴۲ به مدت ۳ تا ۶ ساعت خواهد بود.) تلقیح کنید. مایه تلقیح شدنی را با چرخاندن لوله در بین دو دست و یا با تکان دادن فلاسک در تمام قسمت شیر پخش کنید.

۲- شیر تلقیح شده حاصل را تا وقت بعدی آزمایشگاهی در حرارت آزمایشگاه (روی میز کار خود) بگذارید. (بهتر است آن را به مدت ۱۲ تا ۱۸ ساعت در حرارت ℃۲۱ قرار دهید.)

٣- شیر ترش بدست آمده را تکان دهید تا لخته‌های آن خرد شود، بو و مزه باترمیلک کشت شده حاصل را مورد توجه قرار دهید.

شرکتهای مختلف، کشت‌های آغازگر را به صورت گرد خشک در دسترس قرار می دهند. این خمیر مایه‌ها را باید چندین بار به شیر منتقل کرد تا در آخر نوع متناسب آن حاصل شود .

خودآزمایی

١- برای تعیین تعداد باکتری‌ها از چه روش‌هایی می‌توان استفاده کرد؟ نام ببرید.

۲- برای تعیین باکتری‌های مدفوع در آب از چه روشی استفاده می‌شود؟

۳- روش‌های تعیین توده‌های سلولی را نام ببرید.

۴- روش تعیین کمی باکتری‌ها را به کمک کشت به طور خلاصه بیان نمایید.

۵- کار شمارشگر بک را توضیح دهید.

۶- طرز محاسبه‌ی باکتری‌ها به کمک شمارش پلیت‌ها را با ذکر یک مثال توضیح دهید.

۷- منظور از نفلومتری و توربیدیمتری در سنجش رشد میکروب‌ها چیست؟

۸- عوامل محیطی مؤثر بر زندگی باکتریها را دسته بندی نموده، بگویید چرا کنترل میکروارگانیسم‌ها عملا دشوار است؟

۹- عوامل مؤثر بر نوع تخمیر مواد غذایی را بنویسید.

۱۰- باترمیلک چیست و چگونه تهیه می‌شود؟